白血病干細(xì)胞標(biāo)志的研究p53對(duì)GRO生物學(xué)作用的影響.pdf

1、研究目的：白血病干細(xì)胞(LSCs)是白血病發(fā)生和耐藥、復(fù)發(fā)的重要原因，其具有自我更新能力。目前的研究表明LSCs存在于CD34+/CD38—/CD123+細(xì)胞群中，但LSCs的精確表面標(biāo)記尚不清楚。LSCs通過(guò)粘附分子與骨髓基質(zhì)相互作用可能會(huì)促進(jìn)白血病細(xì)胞的自我更新失調(diào)和凋亡受阻，這可能是LSCs能夠逃逸化療的機(jī)制之一。因此研究骨髓微環(huán)境(niche)相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記，有助于靶向LSCs治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中我們研究粘附分子N—ca

2、dherin，Tie2和CD44在白血病干細(xì)胞中的表達(dá)及化療對(duì)上述抗原表達(dá)富集的影響，探討其是否為L(zhǎng)SCs的潛在標(biāo)志。
　　 研究方法：用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)63例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)化療前后N—cadherin、Tie2、CD44、CD34、CD38和CD123的表達(dá)，觀察LSCs(CD34+/CD38—/CD123+細(xì)胞群)中N—cadherin，

3、Tie2和CD44的表達(dá)情況。聯(lián)合免疫表型和熒光原位雜交技術(shù)，對(duì)4例伴有t(8；21)移位患者的 BMMNCs，分選純化 CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin+和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2+細(xì)胞群和 CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin—和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2—細(xì)胞群，檢測(cè)AML1/ETO的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)5例AML患者的BMMNC

4、s，分選純化CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin+和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2+細(xì)胞群和 CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin—和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2—細(xì)胞群，檢測(cè)耐藥基因MDR1mRNA的表達(dá)水平情況。
　　 結(jié)果：①在AML患者BMMNCs中N—cadherin和Tie2表達(dá)陽(yáng)性的LSCs比例在停化療當(dāng)天與化療前比較無(wú)明顯差異，在停化療

5、后第7天分別由0.17％、0.02％升高到0.6％、0.94％(P<0.05，P<0.01)，而CD44陽(yáng)性細(xì)胞的LSCs比例由17.28％降低到2.25％(P<0.05)(中位數(shù))；②在LSCs中，N—cadherin，Tie2和CD44表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例在停化療的第7天較化療前分別升高了38.17(P=0.03)、210(P<0.01)、1.01(P=0.15)倍(中位數(shù))，提示N—cadherin+和Tie2+的LSCs細(xì)胞能抵抗化

6、療，可能是潛在的LSCs標(biāo)志；③共表達(dá)N—cadherin和Tie2的LSC細(xì)胞群化療后富集比例高于共表達(dá)CD44的LSCs細(xì)胞群，提示共表達(dá)CD44的LSCs細(xì)胞群可能比較成熟，而共表達(dá)N—cadherin和Tie2的LSCs細(xì)胞群可能是真正的LSC細(xì)胞群；④未緩解病例組中，共表達(dá)N—cadherin、Tie2和CD44的LSCs細(xì)胞群在治療前和停化療后第21天的比例明顯高于緩解組病例，提示共表達(dá)N—cadherin、Tie2和CD4

7、4的LSCs細(xì)胞群可能是微量殘留細(xì)胞，與預(yù)后不良有關(guān)；⑤細(xì)胞遺傳學(xué)分組、CD56表達(dá)強(qiáng)弱分組及治療前外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)分組顯示共表達(dá)N—cadherin和Tie2的LSCs細(xì)胞群在預(yù)后不良組中的比例明顯高于良好組，進(jìn)一步提示N—cadherin+和Tie2+的LSCs與預(yù)后不良有關(guān)；⑥N—cadherin和Tie2在LSCs細(xì)胞群中的表達(dá)水平與臨床骨髓涂片的幼稚細(xì)胞比例顯著相關(guān)，提示檢測(cè)共表達(dá)N—cadherin和Tie2的LSCs細(xì)胞群

8、可作為臨床評(píng)估預(yù)后及微量殘留病的指標(biāo)；⑦分選純化的CD34+/CD38/CD123+/N—cadherin+和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2+細(xì)胞群，檢測(cè)到AML1/ETO的融合信號(hào)分別是87.53％和92.18％，而分選純化的CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin—和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2—細(xì)胞群，檢測(cè)到AML1/ETO的融合信號(hào)分別是72.36％和80.87％，提示AML1

9、/ETO表達(dá)在干細(xì)胞水平，其惡性程度更高。⑧在分選純化的CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin+細(xì)胞中檢測(cè)到N—Cadherin mRNA的表達(dá)，而在CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin—細(xì)胞群中未檢測(cè)到N—Cadherin mRNA的表達(dá)；在分選純化的CD34+/CD38—/CD123+/Tie2+和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2—細(xì)胞群中，一位AML患者的標(biāo)本檢測(cè)到N—Cad

10、herinmRNA表達(dá)，而另兩位AML患者標(biāo)本中未檢測(cè)到N—Cadherin mRNA表達(dá)，提示部分患者LSCs中共表達(dá)N—Cadherin和Tie2；⑨分選純化的CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin+和CD34+/CD38—/CD123+/Tie2+細(xì)胞群，檢測(cè)到MDR1 mRNA，表達(dá)水平分別是8.16±1.07和4.18±3.93，而分選純化的CD34+/CD38—/CD123+/N—cadherin—和CD

11、34+/CD38—/CD123+/Tie2—細(xì)胞群，檢測(cè)到MDR1mRNA，表達(dá)水平分別是0.06±0.06和0.46±0.49，進(jìn)一步說(shuō)明N—cadherin+和Tie2+的CD34+/CD38—/CD123+比N—cadherin—和Tie2—的CD34+/CD38/CD123+對(duì)化療更不敏感。
　　 結(jié)論：共表達(dá)粘附分子N—cadherin和Tie2的LSCs細(xì)胞群具有抵抗化療的作用，能夠通過(guò)化療而富集，并表達(dá)AML1/E