抑癌基因p53對(duì)白血病K562細(xì)胞中心體異常的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種獲得性造血干細(xì)胞克隆增殖性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，由于造血干細(xì)胞移植術(shù)的開(kāi)展、針對(duì)BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制劑的臨床應(yīng)用，慢性粒細(xì)胞白血病患者的生存期明顯延長(zhǎng)，但仍有部分患者在發(fā)病后5年內(nèi)發(fā)生急變。急變及加速期CML患者可檢測(cè)到p53基因突變或缺失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有中心體數(shù)量異常，而且急變期顯示更為嚴(yán)重的中心體異常。中心體異?？蓪?dǎo)致異常有絲分裂、非整倍體的發(fā)生和基

2、因組不穩(wěn)定，已經(jīng)在人類多種實(shí)體瘤和白血病中被檢測(cè)出。P53信號(hào)通路與中心體復(fù)制之間存在著密切的關(guān)系，缺失或突變所致P53功能失活可以誘導(dǎo)中心體增殖，推測(cè)其可能是通過(guò)P53的轉(zhuǎn)錄激活-依賴性和轉(zhuǎn)錄激活-非依賴性途徑對(duì)中心體增殖的調(diào)控。鑒于此，本研究以p53基因突變的白血病K562細(xì)胞為模型，探索外源性野生型p53基因表達(dá)后，p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)K562細(xì)胞中心體異常增殖的影響及可能的機(jī)制，以期尋求用野生型p53基因治療白血病的可能性。

3、 實(shí)驗(yàn)從兩方面進(jìn)行研究，主要方法如下： 1.表達(dá)外源性野生型p53基因的白血病K562細(xì)胞模型的建立分別將含有野生型p53基因（Ad5wtp53）、突變型p53基因（Ad5mtp53）和綠色熒光蛋白基因（Ad5GFP）的重組腺病毒表達(dá)載體在HEK293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，病毒滴度測(cè)定后與polybrene4ug/ml共感染K562細(xì)胞，以空白K562細(xì)胞作對(duì)照，經(jīng)熒光倒置顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組腺病毒載體感染效率，Wester

4、nblot檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)情況。 2.重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因?qū)562細(xì)胞中心體數(shù)量的影響及可能機(jī)制間接免疫熒光染色法和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)γ-微管蛋白、α-微管蛋白和綠色熒光蛋白的表達(dá)，針對(duì)中心體γ-微管蛋白的免疫熒光染色來(lái)定量計(jì)數(shù)中心體數(shù)量。 Westernblot檢測(cè)p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游效應(yīng)分子生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷應(yīng)答基因Gadd45a（growth arrest and DNA-dama

5、ge-inducible，alpha），BubR1（Bub 1related）和AuroraA蛋白的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探討重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因?qū)562細(xì)胞中心體數(shù)量影響的可能機(jī)制。 通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，獲得如下主要結(jié)果： 1.三種重組腺病毒載體Ad5wtp53、Ad5mtp53和Ad5GFP組分別感染K562細(xì)胞24h、48h和72h時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，綠色熒光蛋白的表達(dá)（即重組腺病毒感染效率）逐漸升高，72

6、h時(shí)可見(jiàn)60％以上的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。Ad5wtp53、Ad5mtp53感染K562細(xì)胞72h后P53表達(dá)不同程度的上調(diào)，而Ad5GFP組無(wú)明顯改變。與空白對(duì)照細(xì)胞相比，目的條帶與內(nèi)參α-tublin的光密度比值A(chǔ)d5wtp53組上調(diào)P53蛋白2.31倍，Ad5mtp53組上調(diào)P53蛋白5.46倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 2.Ad5wtp53感染K562細(xì)胞72h后含異常中心體（n>2）的細(xì)胞比例降至（0.38

7、±0.02）％，與空白對(duì)照組（0.71±0.14）％相比差異顯著（P<0.05），但是不能恢復(fù)到正常對(duì)照組（0.08±0.01）％的水平（P>0.05）。而處理72h后Ad5mtp53、Ad5GFP組異常中心體數(shù)量（n>2）的細(xì)胞比例分別為（0.75±0.15）％和（0.69±0.09）％，與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯改變（P均>0.05）。 K562細(xì)胞感染Ad5wtp5372h后，與空白對(duì)照組相比Gadd45a、BubR1蛋白表達(dá)

8、分別上調(diào)93％，88％（p均<0.05）；K562細(xì)胞感染Ad5wtp5348h、72h后Aurora-A蛋白量隨感染時(shí)間延長(zhǎng)逐步下降，與對(duì)照組相比分別下調(diào)49％，56％（p均<0.05）；其他各組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)及結(jié)果可以得出如下結(jié)論： 重組腺病毒介導(dǎo)的野生型p53基因能夠在白血病K562細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)；野生型P53蛋白能夠降低K562細(xì)胞中心體數(shù)量。野生型P53蛋白可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活-依賴途徑上調(diào)G