吉西他濱對CD34+CD38-髓系白血病干細胞的生物學效應.pdf

1、背景：
　　 白血病是由克隆中的多能干細胞或更早期的祖細胞基因突變產(chǎn)生，而停滯在細胞不同的發(fā)育階段，白血病細胞在骨髓和機體其他造血組織中大量增生并浸潤其他器官和組織，以致正常造血功能受抑制，是一類造血系統(tǒng)異常的惡性疾病。目前我國白血病的發(fā)病率大約為4～5/10萬，在所有惡性腫瘤所致的死亡率中，男性白血病發(fā)病率居第六位而女性居第八位。但是在兒童及35歲以下成人中白血病發(fā)病率居第一位，是導致青少年死亡的首要疾病。急性髓細胞白血病是成

2、人白血病的主要類型，大約占成人各種白血病的60％，死亡率較高。雖然近年來治療方法有了很大改進，急性白血病的完全緩解率、生存率較前有明顯的提高，但15％-25％患者因為藥物抵抗仍不能獲得完全緩解，并且40％的完全緩解患者在兩年內(nèi)復發(fā)。白血病干細胞位于細胞克隆起始階段，具有跟正常干細胞一樣自我更新能力和分化潛能，但卻喪失正常干細胞的自我調(diào)控能力，被認為是白血病發(fā)生的根源，其可以抵抗常規(guī)的化療和放射治療，又是白血病復發(fā)和轉(zhuǎn)移的種子細胞。只有消

3、除白血病干細胞才能提高白血病治愈率，降低復發(fā)率，以白血病干細胞為靶的治療正在成為治療的新定位。KG1a細胞株是從一男性急性髓系白血病患者體內(nèi)獲得，此細胞株對粒細胞、巨噬細胞集落刺激因子無反應，研究發(fā)現(xiàn)其高表達CD34抗原，部分缺失CD38抗原，白血病干細胞具有CD34+CD38-表型特性，由此可見，CD34+CD38-KG1a細胞是一種具有白血病干細胞表型的細胞株，可以應用于對白血病干細胞的研究。具有CD34+CD38-表型的KG1a細

4、胞對化療藥物耐藥并抵抗自然殺傷細胞殺傷作用。因此，本研究擬以處于分化早期階段的急性髓系白血病KG1a細胞作為研究的靶細胞。
　　 吉西他濱(gemcitabine，GEM)結(jié)構(gòu)為2'-脫氧-2'，2'-鹽酸二氟胞苷(β2異構(gòu)體)，在結(jié)構(gòu)上與阿糖胞苷（Cytarabine，Ara-C）相似，系阿糖胞苷2'-碳上的氫和羥基被雙氟取代，是一種新型嘧啶類核苷酸抗代謝腫瘤藥物，并且還屬于細胞周期特異性抗癌藥。其主要作用于細胞S期，也可以阻

5、止G1期細胞向S期的進展，以此來影響細胞周期重分布，使周期敏感細胞成分增加?，F(xiàn)已證實該藥目前廣泛應用于非小細胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌等實體瘤治療。GEM在惡性血液系統(tǒng)疾病方面的應用，國外開展了GEM治療難治性淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗，均取得較好的療效。而應用于白血病的治療僅限于基礎研究階段。
　　 目前生物免疫治療是繼手術(shù)、化療、放療之后的一種新型治療方法。免疫治療具有抗原識別的靶向性和時空效應性，是以白血病干細胞為靶的治療

6、的根據(jù)。固有免疫效應細胞治療屬于生物治療的一種，其作用機制與化學治療不同，不存在耐藥性問題。自然殺傷(natural kill，NK)細胞是固有免疫的主要效應細胞，具有免疫監(jiān)視作用，可以清除HLA缺失的腫瘤細胞，決定腫瘤細胞被免疫效應細胞殺傷敏感性主要來自HLA-KIR的錯配程度和活化性配體NKG2D(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達水平。靜息狀態(tài)NK細胞受到腫瘤細胞表面NKG2D配體激活，具有殺傷功能，在

7、體外激活后可直接輸注應用。通常白血病干細胞處于靜息狀態(tài)，內(nèi)外源凋亡系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)，表面免疫激活分子低表達。研究顯示，多酚類植物單體能分別激活白血病、淋巴瘤腫瘤干細胞表達MICA/B或ULBP分子，激活NK細胞;可調(diào)節(jié)CSC外源性凋亡受體DR、DcR、casapse-8的表達，使其成為殺傷敏感細胞。不同的細胞因子可以促進NK細胞增殖，而GEM是否能調(diào)節(jié)具有白血病干細胞特性的CD34+CD38-早期急性髓系白血病KG1a細胞被機體免疫細胞

8、對其的殺傷敏感性呢？將是本實驗研究的重點。
　　 因此，本實驗以具有白血病干細胞特性的CD34+CD38-早期急性髓系白血病KG1a細胞為靶細胞，通過細胞克隆形成實驗來研究CD34+CD38-KG1a細胞的分化發(fā)育階段及自我更新能力。采用GEM為干預手段，并與阿糖胞苷作為對比，以細胞克隆，細胞周期，細胞凋亡等指標，觀察GEM對CD34+CD38-KG1a細胞的生物學特性的影響以及研究GEM是否能調(diào)節(jié)CD34+CD38-KG1a細

9、胞被外周血單個核細胞殺傷的敏感性，從而為GEM體外對抗白血病提供實驗室依據(jù)。了解GEM是否具有增強KG1a細胞被PBMC殺傷敏感性，為新的免疫治療方案提供新思路。
　　 第一部分、吉西他濱對CD34+CD38-髓系白血病干細胞的生物學效應
　　 目的：通過檢測干細胞表型、軟瓊脂克隆形成率檢測CD34+CD38-KG1a細胞分化發(fā)育階段及自我更新能力，采用GEM為干預手段，以細胞凋亡、細胞周期、克隆形成為檢測指標，觀察GE

10、M對CD34+CD38-KG1a細胞的生物學效應的影響。
　　 方法：
　　 流式細胞儀檢測(Flow cytometry，F(xiàn)CM) KG1a細胞表面CD34和CD38抗原表達水平;軟瓊脂半固體培養(yǎng)基集落形成法檢測CD34+CD38-KG1a細胞克隆形成率及GEM對KG1a細胞克隆形成率的影響;通過臺盼藍拒染法觀察不同濃度的GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L)和阿糖胞苷分別在24h、48h、7

11、2h對KG1a細胞的增殖影響;利用流式細胞儀檢測各濃度GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5mg/L)和阿糖胞苷作用24h后對KG1a細胞周期變化的影響;流式細胞儀AnnexinV-FITC法檢測不同濃度的GEM(0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L)和阿糖胞苷作用24h后對KG1a細胞誘導凋亡的影響。
　　 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，

12、多組間均數(shù)比較采用析因設計資料的方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 急性髓系白血病KG1a細胞中表型為CD34+CD38-KG1a細胞占(98.02±0.72)％。軟瓊脂培養(yǎng)按每孔2500個KG1a細胞，第14d、21d克隆形成率分別為(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％，說明實驗用KG1a細胞具有白血病干細胞表型及自我更新能力特性。0.05 mg/

13、L、0.1 mg/L、0.5 mg/L的GEM分別作用KGla細胞24d、48d、72d后，增殖抑制呈現(xiàn)時間和劑量依賴，抑制作用明顯強于同濃度同時間阿糖胞苷組（P＜0.05）。0.5 mg/L GEM作用KG1a細胞24小時后有(20.70±3.24)％的KG1a細胞發(fā)生凋亡或壞死，顯著高于鹽水對照組(7.59±1.80)％和阿糖胞苷組(14.22±1.41)％（P＜0.05)。而0.05 mg/L、0.1 mg/L GEM作用KG1a

14、細胞后其凋亡率與鹽水對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。0.05mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L GEM作用KG1a細胞24 h后，軟瓊脂培養(yǎng)第14d，0.1 mg/L和0.5 mg/L組形成的克隆率分別為(15.06±1.15)％和(3.75±0.38)％，低于對照組(21.52±1.75)％（P＜0.05），第21d克隆率為(15.61±1.08)％和(3.91±0.32)％，低于對照組(23.97±0.64)

15、％（P＜0.05），0.05 mg/L GEM組14d、21d的克隆數(shù)分別為(20.28±1.11)％、(18.23±15.73)％，與對照組(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L GEM和阿糖胞苷持續(xù)作用組，按每孔2500個，軟瓊脂培養(yǎng)14d和21d均未見集落生長，與對照組(21.52±1.75)％和(23.97±0.64)％

16、相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明GEM抑制KG1a細胞克隆形成并呈現(xiàn)時間和劑量依賴。0.5 mg/L GEM作用KG1a細胞24d后存活率為(22.93±5.73)％，存活的KG1a細胞中(88.10±1.97)％細胞處于G0/G1期，較鹽水對照組(52.2±7.18)％增加35.9％(P＜0.05)，S期、G2/M期較對照組分別減少31.9％、4.6％（P＜0.05），而0.05mg/L和0.1 mg/L GEM作用KG1

17、a細胞24d后，G0/G1期細胞與鹽水對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 小結(jié)：
　　 1.本實驗所用KG1a細胞具有干細胞表型及生物特性。
　　 2.不同濃度GEM具有抑制CD34+CD38-KG1a細胞增殖作用，并具有劑量時間依賴性，且抑制作用優(yōu)于同濃度同時間組阿糖胞苷組。
　　 3.濃度為0.5mg/L的GEM可將CD34+CD38-KG1a細胞阻滯在G1/G0期。
　　

18、4.GEM對CD34+CD38-KG1a細胞具有早、晚期凋亡作用，誘導凋亡作用優(yōu)于同濃度阿糖胞苷組。
　　 5.GEM顯著抑制CD34+CD38-KG1a細胞的克隆形成能力，抑制CD34+CD38-KG1a細胞的自我更新和增殖潛能，同時持續(xù)平穩(wěn)的藥物濃度增強其抑制效應，抑制作用均強于同濃度阿糖胞苷組。
　　 6.GEM對CD34+CD38-KG1a細胞增殖能力及克隆能力的抑制可能與其使CD34+CD38-KG1a細胞產(chǎn)生

19、G1/G0期周期阻滯和具有早、晚期凋亡作用有關(guān)。
　　 第二部分、吉西他濱對CD34+CD38-KG1a細胞被外周血單個核細胞殺傷的敏感性影響
　　 目的探討GEM作用前后CD34+CD38-KG1a細胞被未活化人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)和IL-2、IL-15活化的PBMC殺傷的敏感性影響。
　　 方法：
　　 通過臺盼藍拒染法觀察

20、不同濃度的GEM（0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L）對KG1a細胞及PBMC的增殖抑制作用;LDH檢測0.1mg/L GEM作用48h后對CD34+CD38-KG1a細胞被IL-2、IL-15活化前后PBMC殺傷的敏感性影響;流式細胞儀檢測0.1 mg/L GEM作用48h后CD34+CD38-KG1a細胞表面NKG2D配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達率。
　　 統(tǒng)計學方

21、法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較采用析因設計資料的方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 在濃度為0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L GEM作用下，隨著GEM濃度的遞增和作用時間延長，其對單個核細胞無增殖亦無毒性作用，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。未經(jīng)IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為

22、10∶1、20∶1時，KG1a細胞被PBMC的殺傷率為(4.87±0.99)％和(6.31±0.46)％，經(jīng)GEM作用48h后KG1a細胞被未經(jīng)活化PBMC的殺傷率為(17.88±3.76)％和(36.60±4.27)％，分別增高了13.01％、30.29％（（P＜0.05）。同等條件下，經(jīng)IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1、20∶1時，未經(jīng)GEM處理的KGla細胞在被IL-2、IL-15活化后的PBMC的殺傷率分別為

23、(25.63±2.95)％和(36.14±4.84)％，而經(jīng)GEM作用后的KGla細胞被IL-2、IL-15活化后的PBMC殺傷率則為(35.30±4.99)％和(53.74±7.74)％，分別增高9.67％，17.6％(P＜0.05)。實驗結(jié)果顯示，GEM能明顯提高KG1a細胞被活化前后PBMC殺傷的殺傷率（P＜0.05），且經(jīng)過IL-2、IL-15活化的PBMC細胞殺傷效應明顯優(yōu)于未經(jīng)活化的PBMC(P＜0.05)。GEM作用48h

24、后檢測KG1a細胞表面NKG2D的配體(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表達與作用前相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 小結(jié)：
　　 1、不同濃度GEM對PBMC增殖無明顯影響。
　　 2、IL-2、IL-15活化后的PBMC細胞殺傷效應明顯高于未活化的PBMC。
　　 3、GEM能增強KG1a細胞被PBMC的殺傷敏感性。
　　 結(jié)論：
　　 1、GEM對