識別白血病干細(xì)胞的新單抗3A4的生物學(xué)特性及基因改造研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 急性白血病是一種最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,占國內(nèi)腫瘤發(fā)病率的第六位,是35歲以下發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤。小兒的惡性腫瘤中以白血病的發(fā)病率最高,每年至少以1.5萬新病人的速度遞增[2]。雖然聯(lián)合化療和造血干細(xì)胞移植大大提高了患者的總體完全緩解率(CR)和五年無病生存率(DFS),但是,仍有相當(dāng)一部分患者因為不能耐受化療相關(guān)的毒副作用和復(fù)發(fā)而治療失敗。分子靶向治療能夠特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,最大限度地減少非

2、靶向組織細(xì)胞的毒副作用,因此,成為白血病治療研究的熱點。其中,單抗導(dǎo)向的靶向治療是分子靶向治療研究的重要領(lǐng)域[28,29]。
　　 近年,CD20[15]和CD33[30]等單抗已在臨床分別廣泛應(yīng)用于B系非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)和AML的治療,取得了一定的療效。為了更有效地治療白血病,需要研制和開發(fā)更多的能夠識別白血病細(xì)胞的單克隆抗體(單抗,Mab)藥物。白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells,LSCs)是白血

3、病復(fù)發(fā)的根源,如果有單抗能夠較特異性地靶向白血病干細(xì)胞,白血病的治療和預(yù)后將會有新的突破。
　　 3A4是本實驗室自行研制的鼠抗人CD45RA單抗,前期研究發(fā)現(xiàn),與現(xiàn)有的抗CD45RA抗體(克隆名:L48)相比,3A4能夠識別更多的白血病幼稚細(xì)胞。并且,3A4能夠識別髓系白血病細(xì)胞系KG1a中超過99％的白血病干細(xì)胞。因此,我們對3A4單抗的生物學(xué)性質(zhì)和功能,3A4基因工程抗體等方面進(jìn)行了深入和系統(tǒng)的研究,以期發(fā)現(xiàn)該新單抗在白血

4、病靶向治療中的潛在應(yīng)用價值。
　　 研究包括兩個部分:1.3A4鼠源性抗體的蛋白性質(zhì)和功能研究；2.3A4基因工程抗體的制備和活性鑒定。
　　 方法：
　　 1、3A4抗體的蛋白性質(zhì)和功能研究。
　　 1.1、3A4抗體的純化和性質(zhì)研究:通過有限稀釋法對3A4雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆,獲得最高純度的雜交瘤細(xì)胞系；通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)鑒定3A4抗體的免疫球蛋白亞類；通過阻滯實驗

5、確定3A4識別的抗原表位；通過SPASepharose親和層析法純化腹水獲得純化抗體,SDS-PAGE鑒定抗體的分子量。
　　 1.2、3A4抗原表達(dá)譜的研究:以改良Marshall法制備直標(biāo)異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)抗體3A4-FITC,FCM比較其和美國Becton-Dickinson(BD)公司的CD45RA(克隆名:L48)識別的抗原(Ag)在白血病細(xì)胞系、初發(fā)白血病

6、幼稚細(xì)胞、復(fù)發(fā)及耐藥自血病幼稚細(xì)胞上的表達(dá)。同時,FCM檢測3A4 Ab識別的抗原在CD34+CD38-CD123+白血病干細(xì)胞上的表達(dá)。
　　 1.3、3A4抗體功能研究:通過木瓜酶消化結(jié)合FCM檢測抗體內(nèi)化程度；通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒實驗(CDC)了解3A4與抗原的特異性結(jié)合及激活補(bǔ)體的能力；通過改良的活潑酯法制備去甲斑蝥素(Norcantharidin)耦聯(lián)3A4抗體免疫毒素(3A4-NCTD),檢測其靶向殺傷功能。

7、　　 2、3A4基因工程抗體的制備和活性研究。
　　 2.1、3A4重、輕鏈可變區(qū)基因克隆:根據(jù)鼠免疫球蛋白重、輕鏈可變區(qū)的恒定區(qū)和框架區(qū)設(shè)計引物,通過RT-PCR擴(kuò)增3A4重、輕鏈可變區(qū)基因序列VH3A4和VL3A4,并將序列克隆至pGEM(R)-T easy載體。
　　 2.2、3A4單鏈抗體ScFv3A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá):設(shè)計包括酶切位點和G4Slinker序列的引物,通過SOE-PCR將VH3A4和VL

8、3A4序列相連,獲得單鏈抗體基因序列ScFv3A4,將該序列插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,以此轉(zhuǎn)染中華倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞,使之表達(dá)單鏈抗體ScFv3A4。FCM檢測抗體活性,競爭結(jié)合實驗測定抗體相對親和力,細(xì)胞免疫熒光法檢測工程細(xì)胞胞漿內(nèi)重組蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測目的基因是否整合至宿主細(xì)胞DNA。
　　 2.3、3A4人鼠嵌合型抗體Hm3A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá):設(shè)計

9、包括酶切位點的引物,擴(kuò)增ScFv3A4基因,將單鏈基因ScFv3A4插入自行改造的嵌合型抗體真核表達(dá)載體pHMCH3(具體改造方法正準(zhǔn)備申請專利,在此不作詳述),以此真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,使之表達(dá)人鼠嵌合型抗體Hm3A4。FCM檢測抗體活性,滴定實驗了解其培養(yǎng)上清中的抗體滴度,競爭結(jié)合實驗測定抗體相對親和力,細(xì)胞免疫熒光法檢測工程細(xì)胞胞漿內(nèi)重組蛋白的表達(dá),RT-PCR檢測目的基因是否整合至宿主細(xì)胞DNA。
　　 2.4、嵌

10、合抗體Hm3A4功能研究:以無血清培養(yǎng)Hm3A4CHO,通過SPASepharose親和層析法純化培養(yǎng)上清,Western-blot鑒定蛋白分子量。通過CDC作用檢測Hm3A4是否能夠激活補(bǔ)體殺傷靶細(xì)胞,通過抗體依賴介導(dǎo)細(xì)胞毒(ADCC)作用檢測Hm3A4是否具有抗體依賴介導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1、鼠源性抗體的蛋白性質(zhì)和功能研究。
　　 1.1、3A4Ab的純化:亞克隆獲得高純度的細(xì)胞系G2。FC

11、M檢測免疫球蛋白亞型,3A4和羊抗鼠重鏈IgG1反應(yīng)陽性率為99.48％,和羊抗鼠輕鏈κ反應(yīng)陽性率為99.02％。對CD45RA、CD45和CD45RO的阻滯實驗顯示,3A4阻滯前后,CD45RA陽性率分別為98.18％和8.15％；CD45陽性率分別為99.96％和99.77％,CD45RO陽性率分別為99.95％和99.96％。SPA Sepharose親和層析法純化腹水獲得20mg純化抗體,SDS-PAGE鑒定重鏈分子量為57.9

12、kDa,輕鏈分子量為30.0kDa。
　　 1.2、3A4抗原表達(dá)譜的研究:以改良Marshall法成功制備直標(biāo)抗體3A4-FITC。F／P比值為2.24,與理想比值(1～2)接近,滴定結(jié)果顯30.5μg3A4-FITC直標(biāo)抗體即可以飽和1×106KG1a細(xì)胞。3A4抗原和CD45RA抗原(BD公司的CD45RA抗體識別的抗原,下同)在T-ALL的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.313),3A4抗原在白血病細(xì)胞系的表達(dá)高于CD45

13、RA抗原(P=0.045),3A4抗原在B系A(chǔ)LL和AML的表達(dá)明顯高于CD45RA抗原,P值分別為0.009和0.000。3A4抗原在復(fù)發(fā)和耐藥的白血病幼稚細(xì)胞上呈高表達(dá),陽性率>90％,高于CD45RA抗原(P=0.016)。3A4抗原在白血病干細(xì)胞的表達(dá)呈強(qiáng)陽性,陽性率范圍:83.33％-100％,中位值:97.83％。
　　 1.3、3A4抗體功能的研究:通過木瓜酶消化結(jié)合FCM檢測發(fā)現(xiàn),37℃孵育0.25h、0.5h、

14、1h、2h、3h和4h,3A4的內(nèi)化程度分別為5.31％、7.29％、36.91％、69.19％、72.64％和71.81％。4℃孵育抗體不內(nèi)化。免疫毒素3A4-NCTD作用24h、48h、72h和96h,靶細(xì)胞死亡率分別為1.73％、15.27％、25.79％和61.09％。
　　 2、基因工程抗體的制備及活性研究。
　　 2.1、3A4重、輕鏈可變區(qū)基因的序列分析:VH3A4基因全長351bps,VL3A4基因全長3

15、21bps,分別編碼117和107個氨基酸殘基。互聯(lián)網(wǎng)在線分析顯示VH3A4含有4個框架區(qū)(FR)和3個抗原決定簇互補(bǔ)區(qū)(CDR)；VL3A4含有4個FR和3個CDR。
　　 2.2、單鏈抗體ScFv3A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá):ScFv3A4基因序列大小為763bp,將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,以重組載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,G418加壓培養(yǎng)2周、4周和5周的陽性率分別為44.47％、97.80％和99.78％。競爭結(jié)合

16、實驗顯示在5×105KG1a細(xì)胞上,抗體相對親和力為1.2×1010M-1。細(xì)胞免疫熒光染色顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿內(nèi)有重組蛋白的表達(dá)。RT-PCR顯示,以ScFv3A4CHO細(xì)胞cDNA為模板可擴(kuò)增出目的基因條帶。
　　 2.3、嵌合型抗體Hm3A4真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá):將ScFv3A4基因插入表達(dá)載體pHMCH3中。以重組載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,G418加壓培養(yǎng)2周、4周的陽性率分別為96.51％和98.20％。平均熒光強(qiáng)度指數(shù)(M

17、ean Fluorescence Intensity,MFI)分別為86.60和198.23。培養(yǎng)上清滴定實驗顯示:20μl上清可使1×106個KG1a細(xì)胞陽性率達(dá)到97.35％,MFI達(dá)到47.41,當(dāng)上清量增至2ml時,MFI達(dá)到360.71。競爭結(jié)合實驗顯示在5×105KG1a細(xì)胞上,抗體相對親和力為1.1×1011M-1。細(xì)胞免疫熒光染色顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞漿內(nèi)有重組蛋白的表達(dá)。RT-PCR顯示,以Hm3A4CHO細(xì)胞cDNA為模板可

18、擴(kuò)增出目的基因條帶。
　　 2.4人鼠嵌合型抗體Hm3A4的功能研究:Western-blot鑒定分子量,單體分子量約43 kDa,二聚體分子量約100 kDa。CDC實驗發(fā)現(xiàn)Hm3A4對KG1a細(xì)胞的cDC作用隨濃度增高而增強(qiáng),0.05μg／ml、0.1μg／ml、1μg／ml、5μg／ml的抗體對靶細(xì)胞的殺傷率分別為:18.4％、48.6％、70.1％、78.3％。Hm3A4通過ADCC作用對KG1a的殺傷率達(dá)到28.96％

19、。
　　 結(jié)論：
　　 1.3A4單抗能夠識別KG1a細(xì)胞表面的CD45RA抗原,其屬于IgG1K免疫球蛋白亞類。3A4抗體的重鏈和輕鏈分子量分別為57.9 kDa和30.3 kDa。
　　 2.3A4能夠識別比CD45RA更多的B系A(chǔ)LL和AML白血病幼稚細(xì)胞,能夠有效地識別髓系白血病干細(xì)胞和復(fù)發(fā)難治的白血病幼稚細(xì)胞。3A4和抗原結(jié)合后能夠較快地內(nèi)化至胞漿,其免疫毒素能夠有效地靶向殺傷靶細(xì)胞。因此,3A4抗原可