大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、背景：膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)快，且對放化療敏感性差，5年生存率僅為20％左右，因而一直是神經(jīng)外科治療中最為棘手惡性腫瘤之一。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)理論的認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞中僅有一小部分腫瘤細(xì)胞，稱為CSC，真正具有自我更新、無限增殖、多向分化潛能等干細(xì)胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源，而腫瘤中的絕大部分細(xì)胞不具有上述特性。研究者已經(jīng)先后從人類髓母細(xì)胞瘤與不同級別的膠質(zhì)瘤中分

2、離得到了腦腫瘤干細(xì)胞(brain tumor stem cells，BTSC)，因而CSC理論的提出為我們從一個全新的角度認(rèn)識膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并進(jìn)一步開發(fā)出靶向治療措施帶來了希望。 目的：1.明確大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系內(nèi)是否存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞及其生物學(xué)特性。2.比較當(dāng)今主流的CSC鑒定方法在鑒定分離獲得C6腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞過程中的效果。3.探討將C6腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞應(yīng)用于人類BTSC研究中的前景。 方法：1.應(yīng)用無

3、血清培養(yǎng)基(DMEM/F-12，添加bFGF，EGF和B27)培養(yǎng)獲得懸浮腫瘤克隆球；用有限稀釋法在無血清條件下對C6單細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)克隆培養(yǎng)，檢測其自我更新能力；用含血清培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS)誘導(dǎo)分化，以免疫熒光和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測C6單細(xì)胞克隆多向分化能力以及分化抗原的共表達(dá)情況：用含血清培養(yǎng)基擴(kuò)增后，通過裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)檢測C6單細(xì)胞克隆連續(xù)體內(nèi)致瘤能力。2.將無血清培養(yǎng)獲得的C6腫瘤克隆球連續(xù)培養(yǎng)于交替的血清/無血清培養(yǎng)基

4、，檢測C6系中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的比例是否穩(wěn)定：流式細(xì)胞儀與免疫組織化學(xué)檢測不同培養(yǎng)條件下CD133陽性細(xì)胞和分化細(xì)胞的比例。3.應(yīng)用免疫磁珠分離CD133陽性與陰性細(xì)胞；利用Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測分離細(xì)胞的純度：利用BrdUrd染色檢測細(xì)胞的增殖能力：利用有限稀釋單細(xì)胞克隆培養(yǎng)，血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，以及裸鼠體內(nèi)種植的方法分別檢測CD133陽性與陰性C6細(xì)胞的自我更新能力，多向分化能力，以及連續(xù)體內(nèi)致瘤能力。4.將

5、用于流式細(xì)胞術(shù)獲得側(cè)群細(xì)胞的Hoechst 33342染料孵育C6細(xì)胞不同時間，檢測其對C6細(xì)胞的毒性作用，同時檢測ABCG2的表達(dá)；利用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)的方法檢測孵育后C6細(xì)胞的自我更新與無限增殖能力。 結(jié)果：1.C6細(xì)胞系中有>60％的細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中形成懸浮腫瘤克隆球；腫瘤克隆球細(xì)胞中，>80％的單細(xì)胞克隆具有自我更新能力：能在血清誘導(dǎo)下產(chǎn)生表達(dá)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記的子代腫瘤細(xì)胞，并且含血清培養(yǎng)基中的貼壁C6細(xì)胞具

6、有共表達(dá)CD133與GFAP/NSE的現(xiàn)象，而在無血清培養(yǎng)基中的克隆球中該現(xiàn)象很少見：在裸鼠皮下種植后則顯示出連續(xù)致瘤性。2.無血清中形成的C6懸浮腫瘤克隆球被轉(zhuǎn)移到血清培養(yǎng)基后，能夠再次貼壁生長，而隨后的血清/無血清交替培養(yǎng)并不影響C6系中能夠在無血清培養(yǎng)基中形成懸浮腫瘤克隆球的細(xì)胞比例：流式細(xì)胞儀與免疫組織化學(xué)顯示血清培養(yǎng)基中貼壁C6細(xì)胞的CD133陽性率為30％左右，而在無血清克隆球中該比例上升到>85％。3.CD133陽性與陰性

7、C6細(xì)胞中均含有腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，但是前者在細(xì)胞增殖能力與致瘤速度等方面顯著強(qiáng)于后者，而且兩者的克隆球生長方式也存在差異。4.長時間Hoechst 33342染色對于大部分C6細(xì)胞具有毒性作用，使其喪失自我更新能力等CSC特性：但是同時也發(fā)現(xiàn)存在1％左右的Hoechst 33342陰性、ABCG2陽性的側(cè)群細(xì)胞，其仍然保留有CSC的特征。 結(jié)論：1.大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有與人類原發(fā)腦腫瘤中BTSC相似的

8、生物學(xué)特點(diǎn)。2.利用無血清懸浮克隆球培養(yǎng)方法所發(fā)現(xiàn)的C6細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于依賴CD133作為CSC表面標(biāo)記的鑒定方法(>60％．30％)，而且CD133陰性亞群中同樣存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞；Hoeehst 33342的毒性會使無法排出Hoechst 33342的非側(cè)群細(xì)胞喪失CSC的特性。3.雖然今后仍然需要努力尋找到一種更為全面而可靠的BTSC鑒定方法，但是考慮到C6系中大部分細(xì)胞符合目前對CSC的定義，因此其仍不失為一