鼻咽癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞樣SP細(xì)胞的分離鑒定相關(guān)研究.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤組織的異質(zhì)性已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)同。近來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一群具有自我更新以及多向分化等一系列正常干細(xì)胞特征的細(xì)胞，這群細(xì)胞被命名為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells or tumorstem cells，CSCs or TSCs)。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤性，對放療、化療不敏感，即使大多數(shù)腫瘤細(xì)胞被消滅，腫瘤干細(xì)胞依然能夠卷土重來，成為腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一。SP細(xì)胞(side

2、 population cell，SP cell，側(cè)群細(xì)胞)是進(jìn)行骨髓造血干細(xì)胞分離時，利用DNA熒光染料Hoechst 33342和流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特殊細(xì)胞亞群，它們具有自我更新、多向分化能力等一系列干細(xì)胞的生物學(xué)特征。研究人員們已經(jīng)在人體多種正常組織和一些實體腫瘤中分離得到了SP細(xì)胞，初步闡明了SP細(xì)胞的一系列生物學(xué)特征。但是迄今為止仍未見到有關(guān)人類鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)中SP細(xì)胞分離鑒

3、定的報道。 人類鼻咽癌是來源于鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其病因涉及遺傳背景、病毒感染以及生活習(xí)慣和生存環(huán)境等多種因素。在西歐和北美的高加索人群中鼻咽癌的發(fā)生率很低，但在中國南方、東南亞和北非的部分國家卻很常見。由于鼻咽癌在中國廣東省的發(fā)病率位居世界首位，鼻咽癌也有“廣東瘤”之稱。隨著近年來鼻咽癌診斷和治療手段的發(fā)展，患者的5年生存率有了一定提高，但放、化療無效以及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍然是鼻咽癌患者死亡的主要原因。于是，有必要深入研究鼻

4、咽癌的生物學(xué)特性，了解該疾病的發(fā)生發(fā)展過程。其中腫瘤干細(xì)胞研究將有可能成為突破點，為開發(fā)特異有效的靶向性治療方法提供思路，造福于鼻咽癌患者。 研究方法： 將生長狀態(tài)良好的NPC細(xì)胞經(jīng)DNA熒光染料Hoechst33342染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀無菌分選，分別收集熒光陽性的NSP細(xì)胞和熒光陰性的SP細(xì)胞觀察它們的生長速度、周期分布以及形態(tài)差別，并進(jìn)一步觀察它們是否具有干細(xì)胞的多種特征，如自我更新、多向分化能力等。將分選后的細(xì)胞

5、立即接種到培養(yǎng)板，進(jìn)行克隆形成實驗來反映兩個細(xì)胞亞群克隆形成能力是否存在差別；并對分選后常規(guī)培養(yǎng)一段時間的細(xì)胞再次進(jìn)行Hoechst 33342染色分析SP細(xì)胞的比例，觀察它們的多向分化能力；提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行PF-PCR來檢測ABCG2分子RNA水平的表達(dá)，用ABCG2單克隆抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測ABCG2蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)情況。一系列的體外試驗后我們進(jìn)行NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗，觀察兩細(xì)胞亞群在體內(nèi)的致瘤能力，這也是

6、證明腫瘤干細(xì)胞能力所通用的重要指標(biāo)之一。 經(jīng)過以上一系列方法驗證了細(xì)胞的干細(xì)胞特征之后，我們進(jìn)行放療和化療敏感性試驗，觀察它們的反應(yīng)性差別，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，同時，我們探索了可能的相關(guān)機(jī)制。此外，我們采用免疫熒光染色方法來分析細(xì)胞表面角蛋白分子的表達(dá)，希望為進(jìn)一步從SP細(xì)胞亞群中分離鑒定腫瘤干細(xì)胞提供有效的標(biāo)記分子。 最后，鑒于目前關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的來源問題仍然沒有統(tǒng)一的認(rèn)識，我們擬采用理化因素誘導(dǎo)的方法來觀察分化成

7、熟的終末腫瘤細(xì)胞是否可以出現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的表型。經(jīng)過有限稀釋接種細(xì)胞得到單個細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)后，我們對單細(xì)胞克隆進(jìn)行理化因素誘導(dǎo)，觀察處理后的細(xì)胞是否可以產(chǎn)生干細(xì)胞樣表型。首先，我們選用人類鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2，對來自于該細(xì)胞系的NSP表型單細(xì)胞克隆進(jìn)行誘導(dǎo)然后觀察SP細(xì)胞的比例。此外我們還對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-CH細(xì)胞來源的CD133-單克隆細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察干細(xì)胞標(biāo)記物CD133+表達(dá)細(xì)胞比例的變化。 結(jié)果：

8、 我們發(fā)現(xiàn)NPC細(xì)胞系CNE-1、CNE-2、C666-1、SUNE-1和HONE-1中均有不同比例SP細(xì)胞(0.1﹪～6.8﹪)的存在。針對來源于CNE-2細(xì)胞系的SP細(xì)胞我們進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)這些SP細(xì)胞具有正常干細(xì)胞的一些關(guān)鍵特征。這些SP細(xì)胞能夠無限增殖，在相同的培養(yǎng)環(huán)境中比NSP細(xì)胞生長迅速(P<0.001)。與NSP細(xì)胞相比，SP細(xì)胞還具有較高的克隆形成能力(P<0.001)，能夠分化產(chǎn)生NSP細(xì)胞并維持自身SP細(xì)胞的

9、比例在一個較穩(wěn)定的水平。從NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實驗我們發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤能力，10，000個SP細(xì)胞就可以形成腫瘤而NSP細(xì)胞需要至少200，000細(xì)胞才能形成腫瘤，腫瘤形成能力比。NSP細(xì)胞高出至少20倍。 SP細(xì)胞對化療藥物鹽酸米托葸醌、順鉑、絲裂霉素C等都有不同程度的耐受(P<0.001，P<0.05，P<0.05)，研究發(fā)現(xiàn)這種廣譜的耐藥現(xiàn)象與ABCG2分子的表達(dá)相關(guān)。與NSP細(xì)胞相比，SP細(xì)胞對放療不

10、敏感(P<0.05)，但是這種耐受狀態(tài)可以通過藥物Cyclopamine的預(yù)處理而得到改善。經(jīng)過對干細(xì)胞相關(guān)信號傳導(dǎo)通路Sonic Hedgehog(SHH)中重要成員Smo蛋白進(jìn)行Western Blot分析，我們推測SP細(xì)胞的放療耐受現(xiàn)象與Smo蛋白的表達(dá)有關(guān)。 通過免疫熒光染色實驗我們發(fā)現(xiàn)角蛋白分子8和18在SP和NSP細(xì)胞上的表達(dá)水平相似。角蛋白分子19在SP和NSP細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于角蛋白8和18，但是在SP細(xì)胞上的

11、表達(dá)依然高于NSP細(xì)胞(P<0.05)，說明該分子的表達(dá)在SP和NSP細(xì)胞之間存在一定的差異，可能在進(jìn)一步分離鑒定鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞的研究中有一定價值。 克隆誘導(dǎo)實驗中，無論是從人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2分選得到的NSP細(xì)胞或者是篩選出來的NSP單細(xì)胞克隆，在經(jīng)過紫外線以及絲裂霉素C的處理后都不同程度的出現(xiàn)了一小群SP細(xì)胞。而來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-CH的CD133-單細(xì)胞克隆經(jīng)過同樣處理后(處理時間和劑量有所調(diào)整)，也

12、出現(xiàn)了CD133+的亞群。這些數(shù)據(jù)表明物理化學(xué)因素的誘導(dǎo)將有利于腫瘤干細(xì)胞表型的發(fā)生和發(fā)展，為腫瘤干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞來源提供了重要依據(jù)。 結(jié)論： 多種鼻咽癌細(xì)胞系中存在著SP細(xì)胞亞群。經(jīng)過對來源于CNE-2細(xì)胞系的SP細(xì)胞進(jìn)行細(xì)致研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系中SP細(xì)胞具有干細(xì)胞的特征，包括無限增殖和自我更新能力，高克隆形成能力，多向分化潛能以及在小鼠體內(nèi)的強(qiáng)致瘤能力等。ABCG2分子的表達(dá)是SP細(xì)胞具有對多種化療藥物耐受性的可能機(jī)制之