人羊膜細(xì)胞生物學(xué)特性及人羊膜上皮細(xì)胞對(duì)高氧所致肺損傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：分離培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞(human amnion epithelial cells,hAECs)和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amnion mesenchymal stem cells,hAMSCs)并鑒定其生物學(xué)特性，探討hAECs在高氧所致新生大鼠肺損傷中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1. 細(xì)胞分離及鑒定：收集符合選入標(biāo)準(zhǔn)的足月剖宮產(chǎn)胎盤上的羊膜組織，采用低速多次胰蛋白酶-膠原酶消化法，分別分離獲取hAECs及

2、hAMSCs。觀察兩種細(xì)胞形態(tài)，通過繪制生長(zhǎng)曲線了解增殖情況；采用間接免疫熒光染色檢測(cè)角蛋白19（cytokeratin19,CK19）及波形蛋白；流式細(xì)胞儀分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD73、CD44、CD166、CD90、CD105、CD49e等；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測(cè)多能干細(xì)胞標(biāo)志八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(octamer

3、-binding transcription factor4,Oct-4)、Nanog；油紅O染色及茜素紅染色法分別檢測(cè)成脂及成骨誘導(dǎo)分化潛能，對(duì)兩種細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　2. hAECs對(duì)高氧所致肺損傷的作用：8窩（8-12只/窩）出生24h內(nèi)無特定病原體(SPF)級(jí)新生SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、高氧組、高氧+PBS組、高氧+hAECs組。正常組新生大鼠在空氣中常規(guī)飼養(yǎng)12天；高氧組、高氧+PBS組、高氧+hAECs組新

4、生大鼠生后24h內(nèi)放入氧濃度90％的環(huán)境中持續(xù)高氧，常規(guī)飼養(yǎng)。高氧第8天，高氧+hAECs組新生大鼠從氣管內(nèi)注入 CM-Dil熒光標(biāo)記的第3代 hAECs5×105個(gè)，體積40μL；高氧+PBS組新生大鼠從氣管內(nèi)注入PBS液，體積40μL；正常組、高氧組不予任何處理。第10天停止高氧，高氧組、高氧+PBS組、高氧+hAECs組新生大鼠放入空氣中繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)2天。第12天，分別采集各組新生大鼠血液及肺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。用熒光顯微鏡追蹤被標(biāo)

5、記的hAECs；肺組織切片HE染色，觀察對(duì)比各組肺組織病理形態(tài)學(xué)差異，進(jìn)行肺損傷評(píng)分；檢測(cè)各組血清及肺組織中炎性因子白細(xì)胞介素6（interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10,IL-10）含量，氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量及肺組織中髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活

6、性。
　　結(jié)果:
　　1. hAECs和hAMSCs生物學(xué)特性
　　1.1 hAECs為圓形或橢圓形，呈鋪路石樣生長(zhǎng)，最多傳至第5代，hAMSCs為成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，呈放射狀或漩渦狀分布生長(zhǎng)，可傳至30代左右。
　　1.2 hAECs表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志CK19，間有波形蛋白表達(dá)，hAMSCs表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)CK19；兩種細(xì)胞均表達(dá)CD29、CD73、CD44、CD166、CD90及OCT-4、Nanog等標(biāo)

7、志， hAECs不表達(dá)CD49e、CD105。
　　1.3 細(xì)胞成脂油紅O染色可見紅色脂滴，成骨茜素紅染色可見紅色鈣化結(jié)節(jié)。
　　2. hAECs對(duì)高氧所致肺損傷的作用
　　2.1 高氧+hAECs組新生大鼠肺組織中有少量細(xì)胞定植，肺泡間隔厚度減低，輻射狀肺泡數(shù)增多，使肺部急性病理改變得到部分改善。
　　2.2 高氧+hAECs組新生大鼠中促炎因子 IL-6水平較高氧組明顯下降，與高氧+PBS組差異無意義；肺組織

8、中IL-10水平各組差異較大；血清中IL-10水平高氧組明顯高于正常組，余各組之間無差異。
　　2.3 高氧+hAECs組肺組織中SOD、MPO活性增高及 MDA濃度降低均較高氧+PBS組明顯，兩組差異有意義；血清中高氧+hAECs組與高氧組相比SOD活性增高及MDA濃度降低明顯，與高氧+PBS組差異無意義。
　　結(jié)論：
　　1. hAECs和hAMSCs均具有干細(xì)胞特性；
　　2. hAECs可部分改善高氧引起