羊膜上皮細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程皮膚的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.從人足月胎盤羊膜中分離羊膜間充質(zhì)干細胞和羊膜上皮細胞，建立相應(yīng)培養(yǎng)體系，體外共培養(yǎng)兩種細胞探究兩者二維共培養(yǎng)中的相互影響關(guān)系。
　　2.分析鑒定羊膜間充質(zhì)干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）和羊膜上皮細胞(human amnion epithelial cells,hAEC)的干細胞特性以及羊膜上皮細胞作為組織工程皮膚表層種子細胞與人皮膚角質(zhì)形成細胞

2、的相似性。
　　3.通過三維氣液培養(yǎng)以羊膜上皮細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程皮膚。
　　方法：取人足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤機械剖離羊膜，通過胰酶、膠原酶分步消化分離培養(yǎng)人羊膜間充質(zhì)干細胞（hAMSC）、羊膜上皮細胞（hAEC)，通過流式細胞分析術(shù)鑒定兩種細胞CD90等表型情況，通過RT-PCR檢測基因CMYC等的表達情況以鑒定hAMSC與hAEC在基因表達水平的干細胞特性，同時RT-PCR檢測hAEC、hKRT19等基因的表達

3、，免疫熒光染色檢測hAEC K14的表達情況以鑒定其與人皮膚角質(zhì)形成細胞的相似性同時說明其作為組織工程皮膚種子細胞的可行性。將兩種細胞按一定比例進行二維混合培養(yǎng)，繪制細胞生長曲線，研究兩者二維共培養(yǎng)中的相互影響關(guān)系。最后以鼠I型膠原為基質(zhì)用兩種細胞氣液三維培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚，HE染色切片觀察。
　　結(jié)果：
　?。?）成功分離培養(yǎng)了hAMSC和hAEC，體外共培養(yǎng)實驗中hAEC生長狀態(tài)良好具有較快的增殖速度，表型無明顯改變；

4、
　?。?）流式細胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)hAMSC和hAEC均高表達CD90、CD73、CD105，不表達造血干細胞標志CD34以及MHC-II類分子HLA-DR。RT-PCR檢測到hAMSC表達干細胞特性基因CMCY和NANOG，hAEC表達干細胞特性基因CMCY和KLF4，RT-PCR檢測hAMSC表達皮膚角質(zhì)形成細胞特性基因K19、β1-integrin、K8，hAEC表達K19、β1-integrin、K5、K8，免疫熒光染色見

5、hAEC表達與角質(zhì)形成細胞增殖相關(guān)的的特性蛋白K14；
　　(3)通過氣液培養(yǎng)利用兩種細胞成功構(gòu)建組織工程皮膚，HE染色切片顯示其具有一定的皮膚結(jié)構(gòu)，且hAEC發(fā)生了初步分化。
　　結(jié)論：hAMSC與hAEC均有一定的干細胞特性，hAEC與皮膚角質(zhì)形成細胞更具相似性，在特定條件下更易于分化為皮膚角質(zhì)形成細胞。共培養(yǎng)結(jié)果顯示在三維工程皮膚的培養(yǎng)中生長于基質(zhì)部分的hAMSC對表層的hAEC可以起到一定的滋養(yǎng)作用。本研究通過氣液培