人胚胎干細胞體外誘導分化為心肌細胞的實驗研究.pdf

1、第一部分 研究目的： 觀察大鼠骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells MSCs)的分離和培養(yǎng)，通過不同濃度的5-氮胞苷(5-aza-dC)誘導大鼠MSCs分化為心肌細胞的比較，確定合適的的誘導濃度。 研究方法： 抽取大鼠骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法分離MSCs，進行培養(yǎng)、傳代，在第4代MSCs中添加誘導劑5-氮胞苷(5-aza)對其進行誘導分化，其濃度分別為：Oμmol/L、10μmol/

2、L、30μmol/L，觀察細胞形念學的變化，熒光免疫組織化學方法進行鑒定。研究結果： 5-aza-dC作用24h后，隨著時間的延長，加入終濃度為10/μmol/L 5-aza-dC的大鼠MSCs，10d后細胞之間出現(xiàn)連接，排列方向漸趨一致，有肌管形成，部分細胞則死亡。誘導28d后，細胞變稀，周圍伸出多個長的突起，細胞形態(tài)大小不一。而加入終濃度為30μmol/L 5-aza-dC的MSCs，在誘導后第5d，細胞則全部死亡。

3、 結論： 大鼠MSCs體外在5-氮胞苷作用下可定向分化為心肌樣細胞。 第二部分 研究目的： 探討5-氮胞苷(5-aza-dC)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor HGF)作為誘導劑，體外誘導人類胚胎干細胞(Human embryonic stem cell hESC)分化為心肌細胞的最佳誘導分化濃度。 研究方法： 1．將傳代的hESC(PKU-1-1)接種到

4、低粘附六孔板中進行懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Embryonic Bodies EBs)。7d后，分別將EBs接種到四孔板中貼壁培養(yǎng)，分別以5-aza-dC、HGF為分化誘導劑加入分化培養(yǎng)基中，組合成幾種分化培養(yǎng)基，分別為無誘導物組；5-aza-dC組，其濃度分別為：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、2μmol/L；HGF組，其濃度分別為：1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml。通過觀察出現(xiàn)的自發(fā)搏動的E

5、Bs的數(shù)量，計算各組分化成功的EBs數(shù)． 2．光鏡動態(tài)觀察細胞形態(tài)學的變化，熒光免疫組織化學，RT-PCR以及電鏡方法對分化細胞進行鑒定。組間比較用方差分析及t檢驗，以p<0.05，為差異有顯著性，比較各組之間的分化比率。 1.5-aza-dC終濃度為0-10μmol/L時均能在體外誘導hESC向心肌細胞分化，2.5-5μmol/L為最佳誘導濃度。Troponin T及Connexin43的表達呈陽性，并可見清晰肌小節(jié)。

6、RT-PCR檢測MLC-2A、MLC-2V、hANP、β-Actin mRNA表達陽性。電鏡下可見細胞內有肌節(jié)樣結構。細胞分化率比較：2.5μmol/L、5μmol/L組之間無明顯差異(p>0.05)，均明顯高于0μmol/L、10μmol/L(p<0.05)，此外0μmol/L、10μmol/L組之間也沒有明顯差異(p>0.05)。而20μmol/L組的細胞大部分出現(xiàn)死亡。 2．HGF終濃度為1ng/ml、5ng/ml、10n

7、g/ml、30ng/ml時均能在體外誘導hESC向心肌細胞分化，Troponin T及Connexin43的表達呈陽性，并可見清晰肌小節(jié)。RT-PCR檢測MLC-2A、MLC-2V、hANP、NKx2.5、GATA-4、a-MHC、β-Actin mRNA表達陽性。細胞分化率比較：5ng/ml、10ng/ml組之間無明顯差異(p>0.05)，均明顯高于1ng/ml、30ng/ml組(p<0.05)。 結論： 5-aza-