抗菌肽attacin在家蠅胚胎細(xì)胞的表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:以家蠅抗菌肽 attacin為目標(biāo)基因,用自行建立的家蠅胚胎細(xì)胞系(MDEC-07114)及含有桿狀病毒穿梭載體的 Bacmid構(gòu)建家蠅胚胎細(xì)胞真核表達(dá)系統(tǒng),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽attacin進(jìn)行抗菌、熱穩(wěn)定性等生物學(xué)活性研究。
　　方法:1、全基因合成家蠅抗菌肽attacin,將目的基因attacin克隆入PUC57質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后連接到 pFastBacTMHTA供體質(zhì)粒,制備重組桿狀病毒 Bacmid DNA;

2、r>　　2、重組桿狀病毒Bacmid DNA轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞MDEC-07114,提取培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白,SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白,鎳柱純化粗蛋白;
　　3、SDS-PAGE和 Western-Blot檢測(cè)、鑒定蛋白表達(dá)情況;
　　4、表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測(cè):對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)的抑制作用;經(jīng)60-100℃水浴1-30min的熱穩(wěn)定性;經(jīng)pH5.0-10.0的酸堿

3、作用后的耐受性。
　　結(jié)果:1、成功構(gòu)建含家蠅抗菌肽 attacin基因的桿狀病毒表達(dá)載體(Bacmid-pFastBacTM-attacin);
　　2、重組桿狀病毒Bacmid DNA成功轉(zhuǎn)染家蠅胚胎細(xì)胞,細(xì)胞出現(xiàn)直徑變大、停止生長(zhǎng)、分離等現(xiàn)象;
　　3、經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解物粗蛋白均含有分子量為24KD的目的蛋白;
　　4、鎳柱純化粗蛋白后經(jīng)SDS-PAGE和 Western-Blot檢