φC31整合酶介導(dǎo)的外源基因在?；蚪M中整合位點的分析與應(yīng)用.pdf

1、φC31整合酶是在φC31鏈霉菌(Streptomyces)噬菌體中發(fā)現(xiàn)的,可介導(dǎo)噬菌體在細(xì)菌基因組中發(fā)生位點特異性整合的重組酶。它同樣能在哺乳動物細(xì)胞中介導(dǎo)攜帶有34bp attB序列的外源載體與基因組上的某些特定位點發(fā)生特異性整合,基因組上的該位點被稱為假attP位點,其與噬菌體attP位點存在著一定的同源性。假attP位點廣泛存在于多種物種的基因組中,而且每個物種往往存在著多個假attP位點。為了探討應(yīng)用φ31整合酶在大動物上進行

2、遺傳操作和制備轉(zhuǎn)基因研究的可行性和有效性,在?；蚪M尋找適合外源基因整合并使其高效表達(dá)的假attP位點是必須的。本研究在先前發(fā)現(xiàn)的兩個牛假attP位點BpsF1、BpsM1的基礎(chǔ)上,繼續(xù)深入開展對?；蚪M中能介導(dǎo)外源基因高效整合和表達(dá)的假attP位點的研究。
　　 本研究首先利用φC31整合酶介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因?qū)ε６つw成纖維細(xì)胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,并篩選出兩個分別顯示綠色熒光蛋白較強和較弱的克隆,接著用反向PCR的方法對GFP基因

3、在基因組中的整合位點進行擴增。結(jié)果表明,在這兩個細(xì)胞克隆中,外源載體均在attB序列的核心位置與牛基因組發(fā)生整合,說明其發(fā)生了位點特異性重組,染色體上的整合位點稱為?；蚪M假attP位點。擴增出的序列經(jīng)BLAST比對發(fā)現(xiàn),在綠色熒光蛋白表達(dá)較強和較弱的兩個細(xì)胞克隆中,假attP位點分別位于牛的4號染色體(NW_001494928)以及10號染色體上(NW_001492885),我們將其命名為BF4、BF10位點。對這兩個假attP位點的

4、序列分析表明與先前發(fā)現(xiàn)的兩個位點BpsF1、BpsM1一樣,BF4、BF10位點均不在編碼區(qū)。同時我們還運用了熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對這兩個假attP位點在牛染色體上進行定位,結(jié)果顯示BF4位點位于染色體的4q31區(qū),BF10位點位于染色體的10q35區(qū),與比對的結(jié)果相吻合。
　　 接著,我們對這四個牛假attO位點的整合頻率以及分別整合在BF4、BF10位點上的外源基因的表達(dá)情況進行研究。結(jié)果顯示在共57個獨立的細(xì)胞克隆

5、中有42個整合于BF4位點上,占74％(42/57),而整合于BF10、BpsF1位點的細(xì)胞克隆分別占7％(4/57)。另外,沒有發(fā)現(xiàn)整合于BspM1位點的細(xì)胞克隆。該結(jié)果清楚地表明,φC31整合酶介導(dǎo)的外源基因在?；蚪M中的整合并不是隨機的,而且整合位點的選擇明顯地偏好于BF4位點,即BF4位點為整合熱點。通過顯微鏡觀察、ELISA、FACS以及Western Blot的分析,都顯示在BF4位點上整合的GFP蛋白表達(dá)水平明顯高于BFl

6、0位點。ELISA檢測整合于BF4位點上的GFP水平為328μg/mg,是整合于BF10位點上的基因表達(dá)水平的2倍以上。該研究結(jié)果與在人、鼠基因組中存在的熱點位點特征相類似,即整合于熱點位點的外源基因均能得到高效地表達(dá)。這樣,我們在?；蛑邪l(fā)現(xiàn)了一個能被高頻地介導(dǎo)整合,而且能促進外源基因高效表達(dá)的假attP位點。
　　 最后,為了進一步提高外源基因分別整合在BF4或BF10位點上的頻率,我們作了進一步探索,在表達(dá)綠色熒光蛋白的載

7、體上分別加入BF4或BF10位點的旁側(cè)序列,構(gòu)建成插入型同源重組載體,并在線性化位點上引入attB序列,試圖聯(lián)合利用φC31整合酶介導(dǎo)的位點特異性重組以及同源重組機制促進外源基因以更高的頻率整合于目的位點。實驗結(jié)果表明,這種經(jīng)過改造的定向載體能夠提高外源基因在目的位點的整合率,提高水平達(dá)20-50％,其中整合于BF4位點的細(xì)胞克隆占93％,而且整合于BF4位點的外源基因依然維持高效表達(dá)。
　　 本研究結(jié)果對應(yīng)用體細(xì)胞核移植(so