轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因整合位點(diǎn)分析及籽粒敗育的初步研究.pdf

1、玉米(Zea mays L.)作為我國(guó)重要的糧食作物之一，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)中起著重要作用。玉米螟等害蟲嚴(yán)重危害玉米生產(chǎn)，每年導(dǎo)致約10％的玉米產(chǎn)量損失?？瓜x轉(zhuǎn)基因玉米的廣泛應(yīng)用可以有效防治玉米蟲害，降低玉米產(chǎn)量損失，并減少農(nóng)藥使用量。研發(fā)有應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因玉米事件，需要明確外源基因在受體基因組中的整合位點(diǎn)，而且外源基因的整合不能對(duì)玉米生產(chǎn)性狀產(chǎn)生不利影響。
　　本研究所用的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034由本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制，前期研究表明

2、該轉(zhuǎn)化事件的外源基因有一個(gè)拷貝，并且室內(nèi)和田間均高抗玉米螟。但是，在研究過程中發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)基因玉米事件出現(xiàn)籽粒敗育的現(xiàn)象。本文首先運(yùn)用TAIL-PCR分離抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034的側(cè)翼序列，通過構(gòu)建Fosmid基因組文庫(kù)和遺傳定位的方法對(duì)外源基因的整合位點(diǎn)進(jìn)行了研究，并對(duì)該轉(zhuǎn)基因玉米出現(xiàn)的籽粒敗育表型進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過TAIL-PCR分離出IE034中外源基因插入位置上游旁側(cè)序列，發(fā)現(xiàn)外源基因插入到了玉米基因

3、組的重復(fù)序列區(qū)，并且外源基因在插入玉米基因組中的過程中進(jìn)行了復(fù)雜的整合，部分骨架載體整合到玉米基因組中。
　　2、提取轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA，構(gòu)建Fosmid文庫(kù)并篩選到一個(gè)單克隆。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)該單克隆只含有外源基因的5'端側(cè)翼序列，并且側(cè)翼序列為29kb的玉米重復(fù)序列。抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE034與自交系B73構(gòu)建F2代分離群體，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)3∶1分離比，說明外源基因只有一個(gè)插入位點(diǎn)。通過BSR-Seq的方法對(duì)外源基

4、因進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)在玉米1號(hào)染色體和5號(hào)染色體的短臂上均有明顯的峰值。通過分子標(biāo)記驗(yàn)證外源基因插入到5號(hào)染色體上，進(jìn)一步開發(fā)標(biāo)記將外源基因的插入位點(diǎn)縮小在約260 kb的區(qū)間內(nèi)。將構(gòu)建Fosmid文庫(kù)得到的29 kb的玉米重復(fù)序列與這個(gè)區(qū)間內(nèi)的重復(fù)序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)只有一部分能夠比對(duì)上。
　　3、在田間種植過程中，IE034的產(chǎn)量相對(duì)較低，分析發(fā)現(xiàn)主要是因?yàn)楣肷系牟糠肿蚜∮龑?dǎo)致單穗重下降，從而影響產(chǎn)量。為了進(jìn)一步解析轉(zhuǎn)基因玉米IE0