FHC、Bim相互作用在細(xì)胞凋亡中作用及φC31整合酶結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、本論文分兩部分,分別研究了人細(xì)胞中,促凋亡蛋白Bim與鐵蛋白重鏈FHC間的相互作用、FHC抗細(xì)胞凋亡的功能及φC31整合酶的高級結(jié)構(gòu)初步研究。
　　選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種重要的腫瘤基因治療策略,而bcl-2家族基因則是主要的靶點之一。Bim是bcl-2家族促凋亡基因之一,為一個有潛在應(yīng)用價值的細(xì)胞毒蛋白基因。但其作用的細(xì)胞調(diào)節(jié)機制依然沒有充分闡明。我們通過酵母雙雜交分析鑒定可能與Bim相互作用的基因,試圖對Bim在細(xì)胞凋亡

2、中的作用機制有更細(xì)節(jié)的了解。
　　鐵蛋白重鏈FHC(Ferritin Heavy Chain)為一個酵母雙雜交分析新篩選到的Bim相互作用蛋白。FHC在機體內(nèi)結(jié)合鐵離子,維持鐵離子代謝平衡是其已知的重要功能。多種外源因素造成的細(xì)胞損傷的保護機制及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的抗凋亡機制中涉及它的調(diào)控。FHC也是機體對抗活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要手段之一。NF-KB介導(dǎo)的對TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡保護過程

3、中,ROS是FHc誘導(dǎo)的上游事件。ROS介導(dǎo)了NID和BIM誘導(dǎo)的caspase激活及相應(yīng)的凋亡。這些研究提示FHC,Bim參加了這些凋亡信號引起的ROS及隨后的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。Fhc,Bim具體是以怎樣的機制參加這個過程是本課題研究試圖回答的問題。
　　為了驗證Bim和FHC的相互作用,我們在293T細(xì)胞中共表達EGFP-Bim和RFP-FHC融合蛋白。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)基本上都分布在細(xì)胞質(zhì),并且有部分重疊分布,兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)

4、共定位特性提示兩種蛋白質(zhì)相互作用的具備可能性。進一步我們在共表達Bim和myc-FHC的細(xì)胞中,mys-FHC特異性抗體可以從細(xì)胞裂解物中沉淀EGFP-BIM卻不能沉淀GFP。MCF-7有BimL的持續(xù)較高表達,MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染FHC基因情況下,通過免疫共沉淀分析證實了兩者之間存在相互作用。研究試圖通過酵母交配試驗鑒定了FHC、和Bim有相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。篩選提示所有含有BH3 domain的Bim異構(gòu)體都可以和FHC相互作用。提示

5、Bim BH3 domain為介導(dǎo)Bim,FHC相互作用的充分因素。
　　為了鑒定FHC、Bim相互作用的細(xì)胞生物學(xué)功能,我們共轉(zhuǎn)pCMV-myc-FHC或FHC特異性siRNA和pEGF-Bim來揭示FHC的效應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)干預(yù)FHC基礎(chǔ)表達水平對細(xì)胞凋亡沒有顯著影響,但是FHC的過表達能夠部分抵消Bim過表達所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞FHC表達則可以增加Bim介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了揭示FHC抗凋亡的細(xì)胞學(xué)機理,我們研究了氧化壓力下

6、,FHC過表達和FHC低調(diào)表達對氧化劑細(xì)胞毒性的影響。發(fā)現(xiàn)FHC在AD293和MCF-7中表現(xiàn)出對氧化劑細(xì)胞毒作用的保護。FHC也對H2O2存HEK293中引發(fā)的細(xì)胞毒具有保護作用。
　　我們的研究確定了一個新的Bim相互作用蛋白FHC。研究結(jié)果提示,FHC可能參與了bim介導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)并起保護作用,FHC是第一個與BH3 domain相互作用的抗調(diào)亡非bcl-2家族蛋白。
　　鏈霉菌噬菌體φC31整合酶可以將外源

7、DNA序列定點整合到哺乳動物細(xì)胞基因組特定位點上,從而極大的降低了由于外源基因隨機插入造成的基因突變風(fēng)險,可以成為在哺乳動物細(xì)胞中進行轉(zhuǎn)基因位點特異性重組操作和基因治療的有用工具。但是直到現(xiàn)在,對φC3l整合酶結(jié)構(gòu)的認(rèn)識十分粗略,普遍認(rèn)為其N端為催化域,除N端的催化區(qū)之外,龐大的C-端被籠統(tǒng)地認(rèn)為可能起識別結(jié)合DNA底物位點的功能。也沒有發(fā)現(xiàn)與其他重組酶有序列上的相似性,生物信息學(xué)方法對它的二級結(jié)構(gòu)的分析也未能給我們足夠的截取合適片段位

8、置的提示。該整合酶在高等生物細(xì)胞應(yīng)用的低效率和其本身功能結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的缺乏,依然困繞有關(guān)研究和應(yīng)用。
　　我們嘗試培養(yǎng)φC31整合酶蛋白結(jié)晶,希望能夠探索它的分子結(jié)構(gòu),為底物和功能關(guān)系研究和分子改造,及其應(yīng)用提供些有益的線索。由于蛋白在晶體培養(yǎng)緩沖液中的不穩(wěn)定性,沒有獲得可以用于X-ray分析的結(jié)晶。我們又試圖截取它的片段進行結(jié)晶,并嘗試和ATT底物片段的共結(jié)晶。我們用低濃度的胰酶對φC31整合酶進行部分消化后,它表現(xiàn)出較有規(guī)律的消化