雞胚給養(yǎng)維生素C調(diào)控肉雞脾臟發(fā)育和免疫功能的表觀遺傳學(xué)機(jī)制.pdf

1、營養(yǎng)管理與遺傳改良的不匹配導(dǎo)致現(xiàn)代肉雞品種的遺傳潛力得不到充分發(fā)揮，限制了肉雞生產(chǎn)性能的提高，而營養(yǎng)表觀遺傳學(xué)為挖掘肉雞品種的遺傳潛力提供了思路。胚胎發(fā)育早期是表觀基因組重編程的關(guān)鍵時(shí)期，容易受外界環(huán)境的影響，也因此成為表觀遺傳學(xué)研究的焦點(diǎn)時(shí)期。由于部分營養(yǎng)物質(zhì)（如維生素C）無法在蛋中積累，加上不同于哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過程，使家禽胚期營養(yǎng)物質(zhì)干預(yù)變得困難，而雞胚給養(yǎng)技術(shù)為以胚胎發(fā)育期為切入點(diǎn)的家禽營養(yǎng)表觀遺傳學(xué)研究提供了手段。本研究以維

2、生素C為營養(yǎng)素，以雞胚給養(yǎng)為手段，在獲取雞胚DNA甲基化模式的基礎(chǔ)上，選擇不同的處理時(shí)間，初步探究了胚期補(bǔ)充維生素C調(diào)控肉雞生長和免疫的機(jī)理，同時(shí)借助二代測(cè)序技術(shù)研究了雞胚給養(yǎng)對(duì)肉雞脾臟發(fā)育的影響。
　　試驗(yàn)一雞胚發(fā)育過程中基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律
　　本試驗(yàn)旨在優(yōu)化用于基因組DNA甲基化水平檢測(cè)的高效液相色譜法(HPLC)，并探索雞胚發(fā)育過程中DNA甲基化模式。試驗(yàn)首先從DNA提取、酶解體系和檢測(cè)條件三個(gè)方面對(duì)HPL

3、C法進(jìn)行了改進(jìn)，然后以AA肉雞胚胎為材料，檢測(cè)了雞胚發(fā)育過程中基因組DNA甲基化水平變化規(guī)律。試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞胚發(fā)育過程中心臟、肝臟和肌肉的DNA甲基化水平均隨胚齡逐漸升高，且可劃分為三個(gè)明顯的階段:胚胎發(fā)育第2天(E2)～4，E5～13，E14～19;胚胎發(fā)育后期肝臟的DNA甲基化水平顯著高于心臟和肌肉(P＜0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)化后的HPLC法可快速、準(zhǔn)確地測(cè)定各種組織基因組DNA甲基化水平。另外，雞胚發(fā)育過程中基因組DNA

4、甲基化水平階段性逐漸升高。
　　試驗(yàn)二雞胚發(fā)育過程中特異基因甲基化模式
　　本試驗(yàn)旨在研究雞胚發(fā)育過程中特異基因的DNA甲基化模式。研究采用重亞硫酸鹽修飾后測(cè)序法測(cè)定了TNF-α和IGF2啟動(dòng)子和基因體的DNA甲基化水平，并檢測(cè)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)、TNF-α和IGF2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)肌肉和肝臟組織中，TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平呈先升高后降低的變化規(guī)律，且TNF-α基因體的

5、甲基化水平以E17顯著高于E8、E11和E14(P＜0.05);(2)IGF2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平隨胚齡逐漸降低，而基因體甲基化水平持續(xù)升高;(3)肝臟和肌肉中，TNF-α在E17的表達(dá)量均高于其它三個(gè)胚齡（P＜0.05），而在E8、E11和E14的表達(dá)量無差異(P＞0.05);(4)肝臟和肌肉中，IGF2的表達(dá)量均隨胚齡逐漸升高;(5) DNMTs均隨胚齡增加呈現(xiàn)逐漸升高的規(guī)律。本研究結(jié)果提示，不同組織基因組DNA甲基化水平與其整體的

6、基因表達(dá)活性相關(guān)，且基因表達(dá)可能同時(shí)受到啟動(dòng)子區(qū)域低甲基化與基因體高甲基化的調(diào)節(jié)。
　　試驗(yàn)三胚期第11天注射維生素C對(duì)肉雞生長性能及免疫功能的影響
　　本試驗(yàn)旨在探索胚期第11天注射維生素C對(duì)肉雞生長性能、抗氧化性能和免疫功能的影響。240枚AA肉雞種蛋隨機(jī)分為2個(gè)處理，于胚期第11天分別注射0和3 mg維生素C，各處理挑選健康的出殼雛雞，隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10只雞。結(jié)果表明:(1)與生理鹽水注射組相比，胚期第11天

7、注射3 mg維生素C提高了種蛋的孵化率（x2=14.895，P＜0.001），肉雞21-42 d和1-42 d的ADFI(P＜0.05)，1-21 d的ADG和FCR(P＜0.05);(2)提高了肉雞1d血漿維生素C含量(P＜0.05)，且有提高21 d肉雞血漿維生素C含量的趨勢(shì)(P=0.060);(3)提高了35d肉雞T淋巴細(xì)胞增殖活性(P＜0.05)，1d血漿IgA和IgM含量(P＜0.05)，21d血漿溶菌酶活性(P＜0.05)和

8、IgM含量(P＜0.05);(4)提高了42 d肉雞血漿的總抗氧化能力(P＜0.05);(5)提高了21 d肉雞十二指腸的隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度（P＜0.05），及42 d肉雞回腸的絨毛高度/隱窩深度(P＜0.05);(6)提高了21 d肉雞脾臟IL-4、GCN5、DNMT1和DNMT3a的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，同時(shí)降低了IL-1β、Tet2、Tet3和Gadd45β的mRNA表達(dá)量(P＜0.05);(7)提高了42 d

9、肉雞脾臟IL-4、GCN5、Tip60、DNMT3a和Gadd45a的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，降低了IFN-γ、Tet3、MBD4和TDG的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，同時(shí)有降低SVCT1和SVCT2 mRNA表達(dá)量的趨勢(shì)(P=0.065，P=0.095)。本研究結(jié)果提示，胚期第11天注射3 mg維生素C提高了種蛋的孵化率，在一定程度上改善了肉雞的生產(chǎn)性能，抗氧化能力，免疫功能和腸道形態(tài)，且免疫功能的提高可能與DNA甲基化和

10、組蛋白乙?；降奶岣哂嘘P(guān)。
　　試驗(yàn)四胚期第15天注射維生素C對(duì)肉雞生長性能及免疫功能的影響
　　本試驗(yàn)旨在探索胚期第15天注射維生素C對(duì)肉雞生長性能、抗氧化性能和免疫功能的影響。240枚AA肉雞種蛋隨機(jī)分為2個(gè)處理，于胚期第15天分別注射0和3 mg維生素C，各處理挑選健康的出殼雛雞，隨機(jī)分為6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)10只雞。結(jié)果表明:(1)與生理鹽水注射組相比，胚期第15天注射3 mg維生素C提高了種蛋的孵化率(x2=4.21

11、9，P=0.040);(2)提高了1和42 d肉雞的胸腺指數(shù)(P＜0.05);(3)提高1d肉雞血漿IgM含量(P＜0.05)，21 d血漿溶菌酶活性(P＜0.05)，及IgG和IgM含量(P＜0.05);(4)提高了42 d肉雞血漿的總抗氧化能力(P＜0.05);(5)提高了21 d肉雞十二指腸的隱窩深度(P＜0.05)，降低了回腸的絨毛高度/隱窩深度(P＜0.05)，提高了42 d肉雞十二指腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度(P＜0.

12、05);(6)提高了21d肉雞脾臟DNMT1的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，同時(shí)降低了IL-6、IFN-γ、Tetl和TDG的mRNA表達(dá)量(P＜0.05);(7)提高了42 d肉雞脾臟GCN5、DNMT1、DNMT3B和Gadd45β的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)，同時(shí)降低了IL-6、TNF-α和MBD4的mRNA表達(dá)量(P＜0.05)。本研究結(jié)果提示，胚期第15天注射3 mg維生素C提高了種蛋的孵化率，在一定程度上改善了肉雞的抗

13、氧化能力，免疫功能和腸道形態(tài)，且免疫性能的提高可能與DNA甲基化和組蛋白乙酰水平的提高有關(guān)。
　　試驗(yàn)五胚期注射維生素C調(diào)控肉雞脾臟發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組分析
　　本試驗(yàn)旨在借助轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）揭示胚期注射維生素C調(diào)控雞胚脾臟發(fā)育的差異表達(dá)基因及相關(guān)調(diào)控通路。120枚AA肉雞種蛋隨機(jī)分為2個(gè)處理，于胚期第11天分別注射0和3 mg維生素C。胚期第19天，每處理選取發(fā)育良好的種蛋15枚，完整取脾臟，混合后提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組

14、測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，處理組與對(duì)照組共得到12 Gb有效且高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，與參考基因組的比對(duì)效率分別達(dá)到90.76％和91.41％。差異表達(dá)分析共發(fā)現(xiàn)184個(gè)差異表達(dá)基因，其中117個(gè)表達(dá)上調(diào)，67個(gè)表達(dá)下調(diào)。GO和KEGG等生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)基因涉及免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、組蛋白修飾和繁殖等生物過程。本研究結(jié)果提示，以雞胚給養(yǎng)為手段施加胚期維生素C干預(yù)可影響胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和表觀遺傳學(xué)修飾等生物過程。
　　試驗(yàn)六胚期注射維生

15、素C調(diào)控肉雞脾臟發(fā)育的全基因組甲基化分析
　　本試驗(yàn)旨在借助全基因組甲基化測(cè)序(WGBS)揭示胚期注射維生素C調(diào)控雞胚脾臟發(fā)育的差異甲基化基因及相關(guān)調(diào)控通路。120枚AA肉雞種蛋隨機(jī)分為2個(gè)處理，于胚期第11天分別注射0和3 mg維生素C。胚期第19天，每處理選取發(fā)育良好的種蛋15枚，完整取脾臟，混合后提取DNA進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，對(duì)照組與處理組共得到98 Gb有效且高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，平均測(cè)序深度32X。甲基化分析發(fā)

16、現(xiàn)，胚期注射維生素C改變了脾臟組織的甲基化模式，且其去甲基化作用主要體現(xiàn)在CHG和CHH位點(diǎn)及基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)。生物信息學(xué)分析共得到5514個(gè)差異甲基化基因，涉及免疫調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、表觀遺傳學(xué)修飾、繁殖和氧化還原等生物過程。本研究結(jié)果提示，胚期補(bǔ)充維生素C改變了參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和表觀遺傳學(xué)修飾等生物過程相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)。另外，研究揭示了雞胚脾臟全基因組甲基化圖譜，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)七胚期注射維生素C調(diào)

17、控肉雞脾臟發(fā)育的RNA-seq與WGBS組合分析
　　本試驗(yàn)旨在將RNA-seq數(shù)據(jù)與WGBS數(shù)據(jù)進(jìn)行組合分析，找出共有差異基因，并進(jìn)行相關(guān)功能分析。組合分析共發(fā)現(xiàn)59個(gè)差異甲基化且差異表達(dá)基因，其中處理組相比對(duì)照組的去甲基化率為98.3％，涉及胚胎發(fā)育、免疫功能和表觀遺傳學(xué)修飾，表明胚期注射維生素C通過廣泛的去甲基化作用參與調(diào)控胚胎發(fā)育、免疫功能和表觀遺傳學(xué)修飾等生物過程。本研究結(jié)果揭示了胚期維生素C干預(yù)下DNA甲基化與基因表達(dá)