淋巴性腦水腫大鼠的血壓變化及其機(jī)制探討.pdf

1、目的：1.探討LBE對(duì)清醒自由活動(dòng)大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)的影響；2.探討孤束背內(nèi)側(cè)亞核的組織病理變化在LBE后血壓及血壓調(diào)節(jié)的改變中的作用；3.探討AQP4在LBE中的作用；4.探討血漿AngII及ANP在LBE后血壓及血壓調(diào)節(jié)的改變中的作用。 方法：1.淋巴性腦水腫動(dòng)物模型的建立選用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，參照Casley-Smith創(chuàng)立的并由本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的方法建立淋巴性腦水腫動(dòng)物模型。具體方法如下：大鼠在鹽

2、酸氯胺酮50 mg/kg和地西泮5 mg/kg腹腔注射麻醉下，取仰臥位固定，頸部正中切口，分離兩側(cè)的頸淺淋巴結(jié)(每側(cè)各3～5個(gè))，結(jié)扎相應(yīng)的淋巴管，并摘除頸淺淋巴結(jié)。然后進(jìn)一步分離出兩側(cè)的頸深淋巴結(jié)(每側(cè)各1～2個(gè))，同法結(jié)扎其兩端的淋巴管，并摘除頸深淋巴結(jié)，阻斷頸部淋巴引流，造成淋巴性腦水腫；2.動(dòng)物分組動(dòng)物隨機(jī)分為以下三組：(1)正常組(Normal組)：僅進(jìn)行股動(dòng)、靜脈插管進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)，不接受頸部手術(shù)，不形成淋巴性腦水腫。(2)淋

3、巴性腦水腫假手術(shù)組(Sham組)：只進(jìn)行頸部假手術(shù)，即分離頸部的淋巴管及淋巴結(jié)，但不結(jié)扎淋巴管，也不摘除淋巴結(jié)，不形成淋巴性腦水腫。(3)淋巴性腦水腫模型組(LBE組)：進(jìn)行頸部手術(shù)，分離頸部的淋巴管及淋巴結(jié)，結(jié)扎淋巴管，并且摘除淋巴結(jié)造成淋巴性腦水腫；3.檢測(cè)指標(biāo)與方法(1)應(yīng)用清醒動(dòng)物血壓監(jiān)測(cè)技術(shù)觀察淋巴性腦水腫術(shù)后清醒自由活動(dòng)大鼠血壓、心率、血壓波動(dòng)性、心率變異性及壓力反射敏感性隨時(shí)間的變化規(guī)律。(2)應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察LBE后

4、孤束核背內(nèi)側(cè)亞核(dorsomedial nucleusof the solitary tract，dmNTS)病理組織學(xué)改變。應(yīng)用抗神經(jīng)元抗體免疫組化染色檢測(cè)LBE后dmNTS內(nèi)主要參與血壓調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，GLU)及γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)表達(dá)的改變。應(yīng)用抗神經(jīng)元抗體免疫熒光染色dmNTS內(nèi)谷氨酸脫羧酶67(glutamic aciddecarboxyl

5、ase-67，GAD67)表達(dá)的改變。應(yīng)用RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測(cè)LBE對(duì)孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)內(nèi)GAD67信使核糖核酸(mRNA)及蛋白表達(dá)的改變。(3)應(yīng)用干濕重法檢測(cè)LBE對(duì)腦干腦水含量改變。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LBE對(duì)NTS內(nèi)水通道蛋白AQP4 mRNA表達(dá)的改變。應(yīng)用抗神經(jīng)元抗體免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)dmNTS的AQP4蛋白表達(dá)的的變

6、化。應(yīng)用Westernblotting技術(shù)，檢測(cè)LBE對(duì)NTS內(nèi)AQP4蛋白表達(dá)的影響。并將AQP4的表達(dá)與腦水含量進(jìn)行相關(guān)分析。(4)應(yīng)用特異性放射免疫均相競(jìng)爭(zhēng)分析法(radioimmunoassay，RIA)，檢測(cè)LBE術(shù)后大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿血管活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ及心房鈉尿肽含量水平，并與血壓作相關(guān)分析；4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間比較采用單因素方差分析和多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

7、 結(jié)果：1.LBE對(duì)清醒自由活動(dòng)大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)功能的影響假手術(shù)組各參數(shù)與正常組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，LBE術(shù)后第1天SBP、DBP、MAP、HR開(kāi)始下降(P＜0.05)，第7天降至最低(P＜0.01)，其數(shù)值分別為111.10±10.79 mmHg，70.46±9.98 mmHg，84.00±7.56 mmHg和324.06±18.06 bpm，至21天恢復(fù)正常。相反，SBPV、DBPV及HRV則在LBE術(shù)后第1天出

8、現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，第7天升至最高點(diǎn)(P＜0.01)，與假手術(shù)組相比分別增加56.65％，69.10％and 40.95％，后逐漸降低，至21天恢復(fù)正常。BRS變化趨勢(shì)與血壓、心率趨勢(shì)相同，與假手術(shù)組相比，LBE后第1、7和15天分別降低23.81％，30％和23.53％(P＜0.01)；2.LBE對(duì)孤束核背內(nèi)側(cè)亞核神經(jīng)細(xì)胞病理組織學(xué)的影響透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，LBE后神經(jīng)元細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜、核膜不清晰、水腫，細(xì)胞質(zhì)

9、少，并出現(xiàn)裂隙、大液泡，核染色深，神經(jīng)元異染色質(zhì)顯著增多、邊集。膠質(zhì)細(xì)胞膜水腫，周圍出現(xiàn)空泡變性。髓鞘變性壞死，血管內(nèi)皮細(xì)胞膜水腫，并出現(xiàn)周圍裂隙。以LBE7天變化顯著。免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LBE后1天Glu免疫組化陽(yáng)性染色細(xì)胞增多，至7天陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目最多和染色強(qiáng)度最高，以后逐漸恢復(fù)。LBE后1天GABA免疫組化陽(yáng)性染色細(xì)胞即見(jiàn)減少，至7天陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目最少，免疫染色強(qiáng)度最低，以后逐漸改善；3.LBE對(duì)孤束核GAD表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)

10、果顯示，假手術(shù)組和正常組大鼠dmNTS神經(jīng)元GAD67蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。與假手術(shù)組比較，LBE組大鼠自術(shù)后1天GAD67免疫熒光陽(yáng)性染色細(xì)胞即明顯增多，以LBE 7天最顯著(P＜0.01)，21天恢復(fù)正常。RT-PCR。結(jié)果顯示，LBE術(shù)后1天NTS組織就有較假手術(shù)組高的GAD67 mRNA表達(dá)(P＜0.05)，7天達(dá)到表達(dá)的高峰(P＜0.01)，Sham組和正常組GAD67表達(dá)水平相似(P＞0.05)。Western blotti

11、ng結(jié)果顯示GAD67蛋白的表達(dá)與mRNA表達(dá)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，在LBE術(shù)后7天升高94.7％。 4.LBE對(duì)腦干腦水含量及孤束核AQP4表達(dá)的影響腦干水含量測(cè)定結(jié)果顯示，正常組和假手術(shù)組大鼠腦含水量在各個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)相比，LBE組大鼠自術(shù)后1天腦組織含水量明顯升高，7天達(dá)高峰，后逐漸恢復(fù)；5.LBE對(duì)血漿中AngII及ANP含量水平的影響與假手術(shù)組相比較，LBE大鼠血漿ANP含量顯著升高(分別為P

12、＜0.05和P＜0.01)，峰值出現(xiàn)在7天。AngII含量顯著降低(分別為P＜0.05和P＜0.01)，谷值出現(xiàn)在7天。正常組和假手術(shù)組大鼠血漿ANP和AngII含量在各個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)明顯差異。相關(guān)分析顯示，AngII和ANP含量與LBE大鼠血壓均呈顯著正相關(guān)(r=0.9584，P＜0.01)和顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.9103，P＜0.01)。 結(jié)論：1.淋巴性腦水腫可導(dǎo)致清醒自由活動(dòng)大鼠血壓及血壓調(diào)節(jié)功能的降低；2.淋巴性腦水腫對(duì)孤束