C-EPO對創(chuàng)創(chuàng)性腦水腫的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、顱腦創(chuàng)傷(TBI)在全身的創(chuàng)傷性疾病中占有非常重要的地位，具有發(fā)病率較高、病情危重、預(yù)后差等特點(diǎn)，給整個社會與家庭均造成極大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。而顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷中均有不同程度的腦水腫存在，是顱腦創(chuàng)傷患者早期死亡或產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙，影響患者疾病預(yù)后重要原因。創(chuàng)傷性腦水腫的機(jī)制探索及新的、有效的神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)，一直是國內(nèi)外學(xué)者積極研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　 近二十年大量的研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)不但可以促進(jìn)紅細(xì)胞

2、生成，而且有著非常有效的抗凋亡、抑制炎癥、促進(jìn)組織再生修復(fù)等保護(hù)作用。而EPO相關(guān)衍生物——氨甲?；偌t細(xì)胞生成素(C-EPO)更是保留了EPO廣泛、有效的神經(jīng)保護(hù)功能，又無促進(jìn)紅細(xì)胞生成的副作用。C-EPO的發(fā)現(xiàn)，為尋找確切有效并且安全可靠的顱腦創(chuàng)傷神經(jīng)保護(hù)藥物提供了新方向。但目前，C-EPO是否能減輕創(chuàng)傷后腦水腫及其具體分子機(jī)制，國內(nèi)外尚無深入研究及報(bào)道。
　　 本研究擬在建立穩(wěn)定可靠的SD大鼠重型顱腦創(chuàng)傷模型、體外氧糖剝奪

3、/復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型的基礎(chǔ)上，①觀察C-EPO對大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦水腫、神經(jīng)功能、水腫相關(guān)蛋白(水通道蛋白4，AQP4)和信號通路（蛋白激酶C，protein kinase C，PKC）等的影響，從行為學(xué)，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等多方面探討C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的作用及可能參與的機(jī)制;②在體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察C-EPO對氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、AQP4及PKC信號通路等的影響，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)，超微結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)等多方面深入

4、探討驗(yàn)證C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的具體分子機(jī)制。
　　 第一部分:氨甲?；偌t細(xì)胞生成素對大鼠創(chuàng)傷性腦水腫的影響
　　 目的:通過觀察C-EPO對大鼠急性重型腦外傷后腦水腫和大鼠神經(jīng)功能的影響，旨在研究其是否有抑制創(chuàng)傷性腦水腫的保護(hù)作用。
　　 方法:168只SD大鼠隨機(jī)分為四組:正常組，假手術(shù)組，腦創(chuàng)傷組，C-EPO治療組。大鼠重型TBI模型造模成功后每天采用腹腔注射100ug/kg的C-EPO或者等體積生理

5、鹽水，于傷后6h、24 h、3d和7d獲取腦組織;采用mNSS觀察大鼠神經(jīng)功能損傷及恢復(fù)情況;干濕重法檢測腦組織含水量;E-B法檢測血腦屏障通透性變化;HE染色檢測傷灶腦組織病理變化。
　　 結(jié)果:①腦含水量:C-EPO治療組大鼠的腦含水量在第6h和1、3d時較腦創(chuàng)傷組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②EB染色:C-EPO治療組大鼠腦EB含量較腦創(chuàng)傷組大鼠傷后1、3d時明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③HE染色:rhEPO組與腦創(chuàng)傷組比

6、較，神經(jīng)細(xì)胞水腫減輕，傷灶中心神經(jīng)細(xì)胞受損及壞死區(qū)縮小。④mNSS評分:C-EPO治療組的mNSS評分較腦創(chuàng)傷組在傷后3、7和14d時出現(xiàn)顯著性降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:C-EPO能顯著減輕大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后腦水腫，降低血腦屏障通透性，改善大鼠創(chuàng)傷后神經(jīng)功能的障礙。初步證實(shí)了C-EPO對重型顱腦損傷后腦水腫有明顯的抑制保護(hù)作用。
　　 第二部分:C-EPO對大鼠顱腦創(chuàng)傷后PKC信號通路酸化和AQP4表達(dá)的影響

7、r>　　 目的：觀察C-EPO對SD大鼠急性重型腦外傷后傷灶周邊PKC磷酸化及AQP4表達(dá)水平的影響，旨在研究探討其抑制創(chuàng)傷性腦水腫保護(hù)作用的潛在分子機(jī)制。
　　 方法：168只SD大鼠隨機(jī)分為四組:正常組，假手術(shù)組，腦創(chuàng)傷組，C-EPO治療組。采用RT-PCR法，檢測大鼠急性重型TBI后傷灶周邊腦組織中AQP4 mRNA的表達(dá)水平;用Western Blot法，檢測PKC的磷酸化水平和AQP4蛋白的表達(dá)水平;用組織免疫熒光染

8、色法，檢測傷灶周邊腦組織中AQP4蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①Real-time PCR:腦創(chuàng)傷組傷灶周邊腦組織中AQP4 mRNA表達(dá)水平明顯升高; C-EPO治療組AQP4 mRNA的表達(dá)水平在傷后6h和1、3d時較腦創(chuàng)傷組均明顯降低。②WesternBlot法:腦創(chuàng)傷組AQP4蛋白的表達(dá)在創(chuàng)傷后出現(xiàn)顯著升高，C-EPO治療組AQP4蛋白在傷后第1、3和7d時較腦創(chuàng)傷組表達(dá)明顯降低。PKC磷酸化水平在傷后有明顯下降，C-

9、EPO治療可以顯著升高創(chuàng)傷后PKC磷酸化的水平。③免疫熒光:腦創(chuàng)傷組AQP4蛋白的熒光表達(dá)均較假手術(shù)組明顯升高，C-EPO治療組AQP4蛋白的熒光表達(dá)明顯低于腦創(chuàng)傷組。
　　 結(jié)論：大鼠重型顱腦創(chuàng)傷后PKC磷酸化水平出現(xiàn)顯著下降，同時AQP4的表達(dá)明顯增高;C-EPO治療能顯著提高傷后PKC的磷酸化水平，降低顱腦創(chuàng)傷后AQP4的高表達(dá)水平。本部分結(jié)果充分提示AQP4及PKC信號通路參與了C-EPO抑制創(chuàng)傷性腦水腫的神經(jīng)保護(hù)作用。

10、
　　 第三部分:C-EPO對星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞水腫的影響
　　 目的：通過觀察C-EPO對體外原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)后細(xì)胞水腫及損傷情況的影響，旨在研究C-EPO是否能夠減輕氧糖剝奪/復(fù)氧引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。
　　 方法：體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，并隨機(jī)分為正常組、OGD/R損傷組和C-EPO治療組。建立氧糖剝奪/復(fù)氧細(xì)胞水腫模型，使用C-EPO(10ng/ml)預(yù)處理

11、星形膠質(zhì)細(xì)胞。在氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后0.5 h，2h，8h和24 h時，用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，電子顯微鏡觀察線粒體等超細(xì)胞微結(jié)構(gòu)變化，[3H]-3-氧-甲基-D-葡萄糖攝法測定細(xì)胞體積變化，乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測細(xì)胞損傷及恢復(fù)情況。
　　 結(jié)果：①光學(xué)顯微鏡: C-EPO治療組星形膠質(zhì)細(xì)胞在傷后胞體及足突的腫脹情況較OGD/R損傷組明顯減輕。②電子顯微鏡:C-EPO預(yù)處理后細(xì)胞線粒體腫脹及溶酶體增高等情況明顯緩

12、解。③細(xì)胞體積:星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧糖剝奪/復(fù)氧后體積明顯增加，C-EPO預(yù)處理組的細(xì)胞體積明顯低于OGD/R損傷組。④LDH漏出率:給予C-EPO預(yù)處理后細(xì)胞在氧糖剝奪/復(fù)氧后的LDH漏出率較OGD/R損傷組明顯降低。
　　 結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了C-EPO預(yù)處理能明顯減輕體外氧糖剝奪/復(fù)氧損傷引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫，減輕細(xì)胞線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)的改變。以上實(shí)驗(yàn)提示C-EPO能夠抑制顱腦創(chuàng)傷后缺血再灌注引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。

13、
　　 第四部分:C-EPO對氧糖剝奪/復(fù)氧后水腫星形膠質(zhì)細(xì)胞中PKC磷酸化和AQP4的表達(dá)的影響
　　 目的：觀察C-EPO及PKC阻斷劑（H-7）對氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、PKC磷酸化及AQP4的表達(dá)的影響，旨在研究C-EPO是否是通過調(diào)節(jié)PKC信號通路磷酸化，降低AQP4表達(dá)水平，以減輕氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。
　　 方法：將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、OGD/R損傷組、C-EPO組和C-EPO

14、+H-7組。用Western Blot法，檢測氧糖剝奪/復(fù)氧后各組細(xì)胞PKC的磷酸化水平和胞膜AQP4蛋白的表達(dá)水平;用細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)染色法，檢測細(xì)胞AQP4蛋白的表達(dá)水平;用RT-PCR法檢測相應(yīng)細(xì)胞AQP4 mRNA的表達(dá)水平;測定各組細(xì)胞體積和LDH漏出率的變化。
　　 結(jié)果：OGD/R損傷組細(xì)胞PKC磷酸化水平在氧糖剝奪/復(fù)氧后明顯下降，同時胞膜AQP4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高;C-EPO治療組后細(xì)胞PKC磷