熱療對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一．熱療對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 目的：觀察相同時(shí)間內(nèi)不同加熱溫度對(duì)人肺癌A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響，探討熱療對(duì)表達(dá)不同狀態(tài)P53基因肺癌細(xì)胞的促凋亡機(jī)制。 方法：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549、H1299細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(40℃、42℃、44℃加熱組)和對(duì)照組(37℃加熱組)。對(duì)照組：分別將人肺癌A549、H1299細(xì)胞裝入離心管，37℃水浴放置2h；實(shí)驗(yàn)組：分別將人肺癌A549、H1299細(xì)胞放置入離心管

2、中在40℃、42℃、44℃水浴中加熱2h。上述細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理后繼續(xù)置入37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法分別檢測(cè)不同溫度的熱療對(duì)人肺癌A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；流式細(xì)胞技術(shù)分別觀察不同溫度的熱療對(duì)人肺癌A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響；RT-PCR分別檢測(cè)不同溫度的熱療對(duì)人肺癌A549、H1299細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、Caspase-3表達(dá)的影響。 結(jié)果：①人肺

3、癌A549細(xì)胞在加熱至40℃、42℃、44℃維持2h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為：29.0％，47.6％，78.4％；人肺癌H1299細(xì)胞在加熱至40℃、42℃、44℃維持2h后，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為：17.1％，32.2％，69.3％?？梢?jiàn)，熱療對(duì)人肺癌A549、H1299兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，隨加熱溫度的升高兩種細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的程度越強(qiáng)，加熱后A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯高于H1299細(xì)胞。②人肺癌A549細(xì)胞在加熱至37℃、40

4、℃、42℃、44℃，各維持2h后，G0/G1期細(xì)胞的比例分別為：67.842±1.463％，62.173±1.324％，52.871±0.539％，54.983±1.217％；凋亡率分別為：0.505±0.109％，5.812±1.356％，14.249±0.499％，10.315±1.162％。人肺癌H1299細(xì)胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，G0/G1期細(xì)胞的比例分別為：64.196±1.324％，64.74

5、3±0.979％，62.985±2.364％，63.623±1.657％；凋亡率為：0.593±0.247％，4.918±1.326％，10.454±0.473％，9.285±0.321％。可見(jiàn)，熱療可以明顯改變?nèi)朔伟〢549細(xì)胞生長(zhǎng)周期的分布，G0/G1期細(xì)胞明顯減少，并以42℃加熱時(shí)G0/G1期細(xì)胞減少最為明顯。但是，加熱對(duì)人肺癌H1299細(xì)胞生長(zhǎng)周期的分布影響不大。不同溫度加熱后A549細(xì)胞的凋亡率明顯高于H1299細(xì)胞，并以42

6、℃時(shí)凋亡率最高。③40℃、42℃、44℃的熱療后A549細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并以42℃加熱組P53蛋白的表達(dá)最為明顯；加熱并不能誘導(dǎo)H1299細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)。然而，40℃、42℃、44℃的熱療能同時(shí)誘導(dǎo)A549、H1299兩種細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，不同溫度加熱后A549細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)均高于H1299細(xì)胞，并且以A549細(xì)胞、42℃加熱組中Caspase-3蛋白的表達(dá)最強(qiáng)。 結(jié)論：

7、①熱療能明顯抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且隨加熱溫度的升高細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的程度增強(qiáng)。②熱療可以通過(guò)抑癌基因P53途徑改變肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，使其阻滯在G0/G1期，并且最終通過(guò)激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。③在肺癌細(xì)胞熱療過(guò)程中，以42℃加熱2h對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期及凋亡的影響最大。二.熱療對(duì)肺癌A549細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響目的：觀察相同時(shí)間內(nèi)不同加熱溫度對(duì)人肺癌A549細(xì)胞表面共刺激分子B7-H1(PD-L1）、B7-H3以及熱休克蛋白H

8、SP-70表達(dá)的影響，探討共刺激分子B7-H3以及熱休克蛋白HSP-70在熱療后的腫瘤免疫中可能發(fā)揮的作用。方法：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(40℃、42℃、44'C加熱組)和對(duì)照組(37℃加熱組)。對(duì)照組：將人肺癌A549細(xì)胞裝入離心管，37℃水浴放置2h；實(shí)驗(yàn)組：將人肺癌A549細(xì)胞放置入離心管中在40℃、42℃、44℃水浴中加熱2h。上述細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同溫度加熱處理后繼續(xù)置入37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用流式細(xì)胞

9、技術(shù)觀察不同溫度的熱療對(duì)人肺癌A549細(xì)胞表面PD-L1，B7-H3表達(dá)的影響；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同溫度加熱處理后A549細(xì)胞中HSP-70的表達(dá)。結(jié)果：①肺癌A549細(xì)胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，細(xì)胞中B7-H3的表達(dá)分別為；0.8％，90.7％，97.3％，86.0％；而人肺癌A549細(xì)胞在加熱至37℃、40℃、42℃、44℃，各維持2h后，細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)分別為：0.6％，0.6％，0.7％，

10、0.9％，均為陰性表達(dá)。可見(jiàn)，熱療能夠明顯上調(diào)人肺癌A549細(xì)胞表面B7-H3的表達(dá)，并且以42℃加熱組中B7-H3的表達(dá)量最高；但熱療不能改變A549細(xì)胞表面的PD-L1的表達(dá)。②37℃組HSP-70在A549細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，40℃、42℃、44℃的熱療能夠使A549細(xì)胞中的HSP-70呈陽(yáng)性表達(dá)；并且以42℃加熱組中HSP-70呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在44℃加熱組中HSP-70雖然也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，但大部分細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，細(xì)胞出現(xiàn)壞死。