基于中和表位的戊型肝炎病毒基因免疫的研究.pdf

1、戊型肝炎(hepatitisE，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起的急性病毒性肝炎，具有發(fā)病急、癥狀重、死亡率高等特點(diǎn)[1]。HEV有4個(gè)主要的不同基因型(Ⅰ-Ⅳ型)，流行病學(xué)資料顯示Ⅳ型HEV是引起我國(guó)散發(fā)性戊型肝炎的主要病毒株[2]。目前HE尚無(wú)有效的抗病毒治療藥物，因此HEV疫苗在HE防治中的作用受到人們的重視[3]。基因疫苗是一種倍受人們關(guān)注的新興疫苗，具有制備簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定，特別是具有可同時(shí)誘

2、導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞免疫等優(yōu)點(diǎn)，已用于HEV疫苗的研究[4]。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)HEV中和抗原表位位于其基因組第二讀碼框架(openreadingframe2，ORF2)編碼蛋白的第452-617位氨基酸之間[5,6]，鑒于中和抗原表位在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答中的重要作用，本研究在獲得了來(lái)源于一株第Ⅳ基因型的HEV毒株且含中和表位的抗原片段-p166、p179基因編碼序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了4種不同的真核重組表達(dá)質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞并局

3、部注射小鼠肌肉組織，檢測(cè)它們?cè)隗w內(nèi)、體外的抗原表達(dá)水平并探討載體和目的基因的選擇對(duì)抗原在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的影響；將構(gòu)建的重組質(zhì)?；蛎庖咝∈?，觀察其免疫效果。 方法： 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nested-PCR)法從一只感染HEV的彌猴的糞便懸液中擴(kuò)增獲得HEVORF2G6461～G7035基因編碼序列，進(jìn)行序列測(cè)定后與Genbank中已知的4個(gè)主要基因型的HEV代表株相應(yīng)基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，以確定該HEV毒株的基

4、因型；設(shè)計(jì)特異性引物，以O(shè)RF2G6461～G7035為模板，應(yīng)用PCR法擴(kuò)增HEV-p166和p179的基因編碼序列；將此基因序列分別克隆入不同的真核表達(dá)載體pTR421和pCDNA3.1中，構(gòu)建4種不同的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179，并進(jìn)行雙酶切鑒定和序列測(cè)定；應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將己構(gòu)建的4種不同的真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HepG2人肝癌細(xì)胞并局部注射小鼠肌

5、肉組織；應(yīng)用免疫熒光法和Western-blotting法檢測(cè)目的抗原在體外HepG2細(xì)胞中的表達(dá)水平；應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)目的抗原在小鼠局部肌肉組織中的表達(dá)水平；將能夠在體內(nèi)和體外真核細(xì)胞中有效表達(dá)目的抗原的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pTR421-179基因免疫小鼠，定期眼眶采血，分離血清，間接ELISA法檢測(cè)血清中特異性IgG抗體水平并觀察其動(dòng)態(tài)變化；分離pTR421-179基因免疫后小鼠的脾細(xì)胞，MTT法檢測(cè)其在特異性抗原HEV-p179刺激

6、下的增殖水平。 結(jié)果： 經(jīng)序列測(cè)定和比對(duì)后確定該HEVORF2G6461～G7035序列來(lái)源于第Ⅳ基因型病毒株；獲得了含中和表位的HEV-p166和p179目的抗原的基因編碼序列；成功構(gòu)建了4種不同的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179；免疫熒光和Western-blotting法可以檢測(cè)到pTR421-179在體外轉(zhuǎn)染的HepG2人肝癌細(xì)胞中表達(dá)

7、的目的抗原，免疫組化法可以檢測(cè)到pTR421-179在小鼠肌肉組織中表達(dá)的目的抗原；而應(yīng)用同樣的方法沒(méi)有檢測(cè)到其它3種重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中和體內(nèi)小鼠肌肉組織中表達(dá)的目的抗原；與pTR421質(zhì)?；蛎庖吆蟮男∈笙啾龋琾TR421-179重組質(zhì)?；蛎庖咝∈蠛?，在小鼠的血清可以檢測(cè)到抗-HEV特異性IgG抗體，抗體水平呈現(xiàn)一定的動(dòng)態(tài)變化；MTT法可以檢測(cè)到pTR421-179重組質(zhì)粒基因免疫后的小鼠的脾細(xì)胞在特異性抗原刺激下的增殖反應(yīng)

8、，與pTR421質(zhì)粒免疫組有明顯的差異。 結(jié)論： 獲得了來(lái)自于一株第Ⅳ基因型HEVORF2部分cDNA序列，并在此基礎(chǔ)上獲得了含中和表位的HEV-p166和p179抗原基因編碼序列；通過(guò)檢測(cè)不同真核重組表達(dá)質(zhì)粒在真核細(xì)胞內(nèi)目的抗原的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗原編碼基因和載體的選擇對(duì)抗原在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)有一定的影響，同時(shí)得到了能在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)HEV中和表位的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pTR421-179；pTR421-179重組真核表達(dá)質(zhì)