鴨坦布蘇病毒E蛋白中和表位的鑒定和受體的篩選.pdf

1、鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年初在我國的江浙地區(qū)新發(fā)的一種黃病毒，引起蛋鴨的產(chǎn)蛋量急劇下降甚至停止，給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。近些年對其分離鑒定、基因組特征和診斷方法的報道較多，但是對于該病毒中和表位和受體的研究成果較少，尤其是針對DTMUV蛋白受體的研究至今仍無進(jìn)展。囊膜E蛋白作為DTMUV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，不僅可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體，同時與受體結(jié)合介導(dǎo)病毒的入侵，對揭示病毒感染機

2、制和免疫反應(yīng)至關(guān)重要。
　　本研究克隆并表達(dá)了DTMUV E蛋白，制備了多株單克隆抗體，篩選出一株具有中和活性的單克隆抗體，通過鑒定發(fā)現(xiàn)其中和表位位于E蛋白的DomainⅠ區(qū)域，這是首次在黃病毒E蛋白DomainⅠ區(qū)域發(fā)現(xiàn)的中和表位，豐富了我們對黃病毒中和表位的認(rèn)識。通過對中和抗體的可變區(qū)進(jìn)行克隆、序列分析和單鏈抗體(ScFv)的重組質(zhì)粒構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其輕鏈互補決定區(qū)序列具有顯著的特異性，純化的單鏈抗體具有一定的抗病毒效果，為針對該病

3、的預(yù)防與治療奠定了基礎(chǔ)。
　　采用免疫共沉淀和病毒-受體蛋白結(jié)合試驗(VOPBA)技術(shù)對DTMUV的受體進(jìn)行了初步篩選，但是未檢測分離到與DTMUV易感細(xì)胞結(jié)合的蛋白受體，通過DTMUVE蛋白與血紅細(xì)胞的血凝試驗檢測發(fā)現(xiàn)E蛋白具有一定的血凝活性，提示該病毒受體可能屬于糖類，為該病的防控提供新的思路。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.DTMUVE單克隆抗體的制備與鑒定
　　本研究根據(jù)實驗室分離的鴨坦布蘇病毒W(wǎng)H2014株E基因

4、序列(GenBankKY235382)，構(gòu)建了去信號肽成熟的E蛋白的重組質(zhì)粒pET-28a-E，采用原核誘導(dǎo)表達(dá)和純化系統(tǒng)獲得高純度的E蛋白。將純化后的E蛋白免疫BALB/c小鼠制備針對E蛋白的多株單克隆抗體，通過間接ELISA、間接免疫熒光和Western blot篩選獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3B8G和3F12G。其腹水間接ELISA效價分別為1∶51200和1∶409600;亞類鑒定結(jié)果顯示，McAb3B8G重

5、鏈為IgG1類，McAb3F12G重鏈為IgG3類，輕鏈均為κ鏈;間接免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示，兩株單抗均能與過表達(dá)的E蛋白具有特異性結(jié)合反應(yīng)，并且與DTMUV同樣產(chǎn)生特異性反應(yīng)。病毒中和實驗結(jié)果表明，McAb3B8G對DTMUV的中和效果較好。
　　2.E蛋白中和抗原表位的鑒定
　　通過生物信息學(xué)方法分析DTMUV E蛋白空間構(gòu)象，對E蛋白的三個結(jié)構(gòu)域進(jìn)行裁短突變體真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建，間接ELISA、

6、間接免疫熒光和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)McAb3B8G識別E蛋白的DEI區(qū)域，McAb3F12G識別E蛋白的DomainⅡ區(qū)域。為了進(jìn)一步鑒定效果較好的中和抗體3B8G在E蛋白DEI區(qū)域內(nèi)的抗原表位最小功能區(qū)，本研究通過構(gòu)建一系列覆蓋E蛋白DomainⅠ全長的截短突變體真核表達(dá)重組質(zhì)粒，經(jīng)IFA和Western blot檢測，精確掃描定位了McAb3B8G識別的一個B細(xì)胞線性表位1FSCLGMQ7。
　　3.抗DTMUV

7、E蛋白單鏈抗體的制備與鑒定
　　本研究在成功制備穩(wěn)定分泌抗DTMUV E蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，對兩株單抗的VL區(qū)域擴增，比對分析其序列發(fā)現(xiàn)兩株抗體在VL區(qū)域相似性較低，決定了抗體識別E蛋白結(jié)構(gòu)域的特異性。通過基因工程方法，拼接抗DTMUVE蛋白單鏈抗體基因并構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-DTMUV-E ScFv，表達(dá)純化得到的單鏈抗體具有良好的抗病毒活性。
　　4.DTMUV E蛋白受體的篩選
　　為了研究D

8、TMUV在易感細(xì)胞上的受體蛋白分子，本研究表達(dá)純化了E蛋白和DomainⅢ蛋白，通過間接免疫熒光法篩選與DTMUV易感細(xì)胞穩(wěn)定結(jié)合的蛋白，發(fā)現(xiàn)E蛋白能夠穩(wěn)定結(jié)合DEF細(xì)胞、DF1細(xì)胞和Vero細(xì)胞。然后采用膜蛋白提取試劑盒提取以上三種細(xì)胞的膜蛋白，將膜蛋白、純化的E蛋白和抗DTMUV的單抗進(jìn)行免疫共沉淀和病毒-蛋白結(jié)合篩選，結(jié)果均未篩選到特異性可分離的DTMUV蛋白受體，血凝試驗提示鴨坦布蘇病毒的受體可能為糖類，為進(jìn)一步研究病毒受體提供