戊型肝炎病毒中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是一種經(jīng)糞口途徑傳播的急性傳染病，在世界各地尤其是發(fā)展中國家廣泛流行，在發(fā)達(dá)國家也有散發(fā)。HE病死率約為0.4﹪，遠(yuǎn)較其他各型肝炎高，患者多為青壯年，孕期婦女病死率高達(dá)20﹪<'[1-2]>，給社會(huì)帶來了很大危害。近年來發(fā)現(xiàn)在豬等動(dòng)物中也有廣泛的戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)感染，使該病成為一種人畜共患病<'[18]>。 目前HE尚無特異的治療方法，也無主動(dòng)

2、和被動(dòng)免疫制劑可供預(yù)防。國內(nèi)外學(xué)者均在致力于HEV疫苗的研究。而衡量疫苗是否有預(yù)防疾病作用的標(biāo)準(zhǔn)，就是看疫苗能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。中和抗體不同于一般的抗體，它能與病毒結(jié)構(gòu)蛋白上的中和抗原表位結(jié)合，阻斷病毒與敏感細(xì)胞的結(jié)合，從而阻止該病毒入侵敏感細(xì)胞，使病毒失去感染性，對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用，對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和預(yù)后起著重要作用。檢測中和抗體的常用方法有動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)體外試驗(yàn)兩種，但目前對(duì)HEV敏感的動(dòng)物只有非人靈長類動(dòng)物<'[6]

3、>，使用非人靈長類動(dòng)物建立動(dòng)物模型，價(jià)格昂貴，方法繁瑣，試驗(yàn)周期長，動(dòng)物飼養(yǎng)要求高，耗費(fèi)大量的人力物力，難以在基層廣泛使用。另外，由于HEV缺乏有效的細(xì)胞培養(yǎng)體系，傳統(tǒng)的體外中和試驗(yàn)鑒定難以進(jìn)行，1997年Meng<'[10]>等發(fā)明了基于PCR和細(xì)胞培養(yǎng)的體外中和試驗(yàn)并用于HEV中和抗體的檢測，但該體外中和試驗(yàn)需要細(xì)胞培養(yǎng)及RT-PCR技術(shù)，方法繁瑣，也難以普遍推廣應(yīng)用。針對(duì)HEV中和抗體檢測存在的問題，本研究的目的是建立一種簡便易行

4、的檢測HEV中和抗體的方法，并進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。本研究利用我們先前獲得的能夠穩(wěn)定分泌HEV中和性單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細(xì)胞株，大量制備和純化HEV中和性MeAb，并進(jìn)行酶標(biāo)記，使待測樣本中的HEV中和抗體與酶標(biāo)記HEV中和性McAb競爭結(jié)合包被抗原上的HEV中和抗原表位，最后根據(jù)酶作用底物顯色反應(yīng)減弱的程度，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物學(xué)樣本中的HEV中和抗體的競爭酶聯(lián)免疫檢測。本研究分為三個(gè)部分，具體研究結(jié)果如下： 一．HEV中和性單克隆抗

5、體的大量制備、鑒定和純化 本實(shí)驗(yàn)室通過B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以p166Chn和p166Bur免疫小鼠后獲得3株雜交瘤細(xì)胞株5G<,5>、1G<,10>和3G<,1>。這3株細(xì)胞所分泌的MeAb均不與單獨(dú)包被的GST發(fā)生結(jié)合，是針對(duì)HEV的特異性抗體。它們分泌的MeAb能和7種不同基因型來源的p166均發(fā)生陽性反應(yīng)，為p166共同型MeAb。用這3株雜交瘤細(xì)胞制備出大量的MeAb，并對(duì)MeAb進(jìn)行了HEV中和活性的鑒定，證實(shí)它們具

6、有中和HEV的作用，是HEV中和性MeAb。分別用正辛酸法，DEAE 52陰離子交換層析法，Protein-G親和層析法3種不同的方法對(duì)MeAb進(jìn)行純化，并對(duì)這3種純化方法的結(jié)果進(jìn)行比較。我們將純化得到的產(chǎn)物系列稀釋后進(jìn)行間接ELIESA檢測抗體滴度，顯示出用正辛酸法和Protein-G親和層析的方法純化的MeAb滴度比DEAE 52陰離子交換層析法高，分別可達(dá)1：10<'6>(5G<,5>)，1：10<'5>(1G10)1：10<'5

7、>(3G<,1>)。經(jīng)SDS-PAGE，純化后的McAb僅在重、輕鏈位置出現(xiàn)明顯條帶，表明純化后的MeAb純度較高。最終選用較經(jīng)濟(jì)、簡便的正辛酸法來純化 McAb，選用抗體滴度高，純度高的 McAb5G<,5>作為下一步酶標(biāo)記的 McAb。 二．HEV 中和性單克隆抗體的酶標(biāo)記 采用改良的過碘酸納法用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記 McAb 5G<,5>，成功的制備出了高質(zhì)量的HRP酶標(biāo)記 McAb 5G<,5>。以不同

8、基因型和亞型 HEV 重組抗原p166的混合物 p166Mix為包被抗原，用直接 ELISA 法檢測 HRP 5G<,5>，方陣滴定的結(jié)果顯示，當(dāng)抗原稀釋度為1：500，HRP-5G<,5>稀釋度為 1：400 時(shí)，OD450 最接近于 1.0。經(jīng)過計(jì)算，標(biāo)記物中 HRP 的含量為0.42mg/ml；5G<,5>含量為0.34mg/ml，酶/抗體摩爾比為1.4：1。 三．HEV中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評(píng)價(jià) 采

9、用 p166Mix 抗原和中和性McAb HRP 5G<,5>，建立了 HEV 競爭 ELISA 的方法，檢測抗．HEV 中和性抗體。確定最佳包被抗原稀釋度為 1：800。選擇合適的抗原包被液為pH9．6的0.05M 碳酸鹽緩沖液。酶標(biāo)微孔板為深圳國產(chǎn)產(chǎn)品。酶標(biāo)抗體 HRP-5G<,5> 的最適稀釋度為1：400。酶標(biāo)抗體稀釋液為0．01M PBS溶液。標(biāo)本用量為 50ul 血清標(biāo)本。以本方法檢測 HEVORF2 重組蛋白疫苗免疫的恒河

10、猴系列血清，免疫組自免疫 4 周開始，血清抗 HEV 中和抗體有明顯升高，并于 8.9 周后達(dá)到高峰，于 6 周左右開始中和抗體競爭抑制率≥50﹪。對(duì)照組自病毒攻擊 4 周后血清抗．HEV 中和抗體開始升高，并于攻毒 9 周后達(dá)到高峰。證明我們建立的 HEV 中和抗體競爭 ELISA 檢測標(biāo)本中的抗-HEV中和抗體行之有效，可用于疫苗的篩選和評(píng)價(jià)。以本方法檢測 20 份 HEV RT-nPCR 陽性的HE病人恢復(fù)期血．清，結(jié)果抑制率均大

11、于 50﹪，檢出率 100﹪。檢測 10 份抗 HAV IgG 陽性、20 份抗 HBV IgG 陽性和 10 份抗HCV IgG 陽性的血清標(biāo)本，結(jié)果全部陰性，說明本方法與甲型、乙型、丙型肝炎病人血清無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。48 份血清標(biāo)本用 ELISA 直接競爭法與 HEV 間接 ELISA法，都檢測出 24 份陽性標(biāo)本和 24 份陰性標(biāo)本，檢出率相同。兩種方法相比，ELISA 直接競爭法檢測到的是血．清中的中和抗體，HEV

12、 間接 ELISA 法檢測到的則是血清中總的 IgG 抗體。將 3 份陽性血．清標(biāo)本在同一時(shí)間段測定 10 次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；將同樣的 3 份陽性血清連續(xù)測定 5 次，每天一次，計(jì)算批間變異系數(shù)；結(jié)果變異系數(shù)均小于 10﹪，顯示本方法的重復(fù)性較好。將試劑盒(包括預(yù)包被微孔板標(biāo)本稀釋液、酶結(jié)合物底物液 A 和 B、終止液)于 37℃溫箱放置 4 天，與放置在4℃冰箱的試劑盒平行檢測3份陽性和1份陰性血清標(biāo)本，進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。經(jīng)配對(duì)T