登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)抗體中和表位與功能研究.pdf

1、登革病毒(DENV)是引起人類疾病的蚊傳播病毒，它能導致無癥狀感染、登革熱(DF)和更嚴重的登革出血熱（DHF）或登革休克綜合征(DSS)。登革疾病的負擔在熱帶和亞熱地區(qū)日益增加，特別是在南美、東南亞和加勒比地區(qū)，在非洲和中東的報道也越來越多。而在我國南方地區(qū)，幾乎每年都發(fā)生DF流行。登革疾病的流行形勢越來越嚴峻，其致病機理還沒有完全弄清楚，但是病毒、宿主的免疫史和個體的遺傳背景在登革嚴重疾病的發(fā)生中都起著重要作用。其中，病毒本身的作用

2、很關鍵。任何一種血清型DENV造成的初次感染都可能使個體在感染不同于初次感染的異型血清型（heterotypic serotype）DENV時，病毒載量增加、潛伏期縮短，從而引起DHF/DSS的機率也大大增加。這與引起再次感染的病毒血清型、基因型、病毒序列以及初次與再次感染的間隔時間都有關系。
　　 為應對日益增加的登革疾病，很多研究機構都在加緊研發(fā)登革疫苗。目前，已經有幾類疫苗在進行臨床前的評價，包括減毒活疫苗、滅活病毒疫苗、

3、基于重組蛋白的亞單位疫苗和裸DNA疫苗等。由于采用基于減毒活疫苗的傳統(tǒng)方法，還沒有研制出可批準使用的疫苗，研究者更多地將目光轉向重組亞單位疫苗。盡管研究登革疫苗是可行的，但是其研發(fā)還是面臨著相當嚴峻的挑戰(zhàn):(1)登革疫苗必須能對4種血清型DENV的感染同時提供保護作用，因而需要研制四價疫苗;(2)登革疫苗要能提供長期的保護。因為有研究報道，初次感染20年以后的再感染時仍會發(fā)生DHF;(3)還沒有合適的復制登革疾病的動物模型;(4)盡管中

4、和抗體的保護性作用已廣為接受，但其與實際保護效果的關系仍需確定;(5)在DENV的傳播模式和病毒株改變時，登革疫苗需要重新評價。因此，要研制出可靠的登革疫苗，就要解決兩方面的難題:一是疫苗的效果，主要指疫苗的保護性;二是疫苗的安全性問題。
　　 DENV的包膜由脂質雙層構成，含有兩類包膜相關蛋白:膜蛋白(envelope，E)和M蛋白(membrane，M)。E蛋白通過結合到細胞受體而參與病毒的吸附及穿入后與內吞體的融合。E蛋白

5、含有3個不同的結構域:結構域Ⅰ(EDⅠ)、EDⅡ、EDⅢ。EDⅢ在病毒顆粒表面是暴露且可及的，而且，重組EDⅢ也能抑制病毒的感染性。多項研究發(fā)現(xiàn)，EDⅢ含有單一血清型特異性(type-specific，TS)表位、針對2～3種血清型DENV的亞復合體反應(sub-complex reactive，sCR)表位以及同時針對4種血清型DENV的復合體反應(complex reactive，CR)表位，多株鼠源單克隆抗體也分別定位到這些表位。

6、研究表明，許多TS和sCR鼠單抗是針對DENV單抗中起主要中和及保護作用的單抗。由此，登革病毒EDⅢ蛋白也成為亞單位疫苗很有前景的備選靶標。另外，最近有關人源單抗的研究認為，針對EDⅢ的單抗僅占人免疫血清中抗DENV總抗體中的很小一部分，而且EDⅢ上的表位不是人抗DENV中和抗體的主要靶標。盡管如此，鼠源單抗的抗原性表位及其中和活性譜仍有許多方面未研究清楚，更加深入的研究對加深了解體液免疫反應的復雜性、改善登革疫苗的免疫策略或研究治療性

7、抗體均有不可替代的作用。
　　 對EDⅢ單抗的抗原性表位和中和活性的研究可加深對疫苗效果的研究，但是，還有一個難題就是疫苗的安全性問題。前已述及，任何一種血清型登革病毒引起初次感染后，由不同血清型引起再次感染時，登革疾病加重的機率大大增加，其背后最主要的機制就是抗體依賴的增強作用(antibody-dependentenhancement，ADE)，即先前存在交叉反應弱中和抗體能與登革病毒結合，增強表達FcγR受體的細胞的感染水

8、平。最近，Dejnirattisai W.等的研究成果也呈現(xiàn)出ADE發(fā)生的復雜性，即抗E蛋白抗體和抗前膜(precursor membrane，prM)抗體均能增強DEN感染。要研制能提供長期保護的四價疫苗，還沒有合適的登革疾病的動物模型對登革疫苗進行安全性評價，因此，登革疫苗的體外評價顯得格外重要。
　　 因此，在本實驗室前期研究中，利用登革病毒重組EDⅢ蛋白免疫小鼠，制備了107株與DENV重組EDⅢ反應的單抗。本研究中，我

9、們首先采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫熒光(IFA)測定法對107單抗的結合特異性(binding specificity)進行檢測，隨后，我們利用已建立的簡單高通量的微中和試驗(ELISPOT-MNT)法對篩選出來的94株單抗的中和活性譜進行全面的檢測和分析。在此基礎上，對94株單抗的抗原性位點進行鑒定分析，以深入認識重組EDⅢ免疫誘導產生單抗的抗原性位點及其與體外保護性作用的關系。然后，我們創(chuàng)新性地建立了簡單高通量的測定

10、DENV ADE效應的方法學，以進行疫苗安全性的評價和登革疾病的風險評估。
　　 由此，本研究的主要目的有三個:第一，對107株單抗的結合特異性和體外保護性作用進行鑒定;第二，對篩選出來的94株單抗識別的抗原性位點進行分析;第三，建立一種簡單高通量的測定登革抗體ADE活性的新方法，實現(xiàn)對登革疫苗體外安全性評價。
　　 由此，本研究共分為如下三個部分的內容:
　　 第一部分登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)單克隆抗體

11、的結合特異性和中和活性鑒定
　　 本實驗室在前期工作中，采用畢赤酵母表達的4種血清型DENV的重組EDⅢ作為免疫原，單獨或混合免疫BALB/c小鼠，制備了107株單抗。本研究中，我們對這些單抗針對不同血清型的結合特異性或交叉反應性、中和活性進行了詳細鑒定。首先，ELISA和IFA測定結果顯示，有94株單抗對重組EDⅢ或DENV感染的C6/36細胞的結合呈現(xiàn)特異性或交叉反應性，包括42株針對單一血清型DENV的TS單抗、26株針對

12、2～3種血清型的sCR單抗及23株針對4種血清型的CR單抗，還有3株黃病毒交叉反應單抗。但是，ELISA和IFA的鑒定結果并不完全相符，推測96孔板上包被的重組EDⅢ蛋白的構象與感染C6/36細胞的登革病毒表面E蛋白的構象的差異可能造成了這種不一致。
　　 隨后，我們借助已建立的ELISPOT-MNT微中和試驗對以上單抗進行體外保護性測定。根據(jù)單抗對病毒的50％抑制濃度（50％ inhibition concentration，

13、IC50）的大小，將單抗分為三類:強（IC50≤1μg/ml）、中等（1μg/ml＜IC50≤50μg/ml）、弱或無中和活性（IC50＞50μg/ml）。DENV-1 TS單抗（17株）、DENV-4 TS單抗（14株）對相應的血清型病毒顯示出強、中、無的復雜中和活性;DENV-2 TS單抗（7株）對DENV-2均無中和活性;DENV-3 TS單抗（3株）對DENV-3均顯強中和活性。sCR單抗（26株）與CR單抗（23株）的中和活性

14、譜均較復雜，即單抗對不同血清型DENV出現(xiàn)強、中或無中和活性。還有3株黃病毒交叉反應單抗均無中和活性。以上結果表明，單抗的結合特性與中和活性并不平行，即結合特異性相似的單抗可能顯示出不同的中和活性譜，我們分析以上差異可能是由于單抗對孤立的重組EDⅢ蛋白與天然病毒粒子表面展示的E蛋白的識別有差異。以上研究明確了眾多EDⅢ免疫單抗的結合能力和體外中和能力，為后續(xù)DENV EDⅢ單抗的抗原性位點鑒定、深入的結構研究和全面的功能測定奠定了良好的

15、基礎。
　　 第二部分登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)單克隆抗體的表位鑒定
　　 DENV的EDⅢ區(qū)被認為是研究亞單位疫苗有前景的抗原性區(qū)域。但是，EDⅢ上的抗原性位點及其與EDⅢ免疫誘導產生單抗的體外保護作用的關系還沒有完全研究清楚。由此，本研究在94株單抗的結合特性及中和活性鑒定基礎上，對其抗原性位點進行詳細的鑒定。
　　 首先，我們對94株單抗進行合成重疊多肽掃描分析，發(fā)現(xiàn)12株單抗（2株DENV-2 TS

16、單抗、5株sCR單抗、1株CR單抗和2株黃病毒交叉反應單抗）分別特異性地識別幾個不同的線性表位，但這12株單抗均無中和活性。相比之下，23株CR單抗中有15株（約占2/3）特異性地識別相同的aa310-319序列，進一步的序列比對和殘基替換證實aa309-320表位是各血清型DENV間高度保守且免疫優(yōu)勢的復合體表位。
　　 值得注意的是，15株CR單抗與4個血清型DENV的重組EDⅢ或感染的C6/36細胞呈現(xiàn)較強交叉反應，但是，

17、它們對4個型DENV具有復雜的中和活性譜，大多數(shù)只顯示弱或中等中和活性。如何解釋這些單抗的結合交叉反應性與中和能力的差異呢？我們繼續(xù)采用位點定向突變和酵母表面展示分析，發(fā)現(xiàn)ABloop上的Q316和H317是該表位的關鍵殘基;而且，三維建模分析表明，該表位在EDⅢ表面充分暴露，但在E蛋白二聚體和三聚體表面的可及性差，特別是在成熟病毒粒子表面可及性更差?？梢哉J為，重組EDⅢ作為免疫原可誘導產生針對在病毒粒子表面不暴露的單抗，因此這些單抗的

18、中和活性較弱。通過研究，我們合理地解釋了定位至EDⅢ AB loop的弱中和活性的交叉反應單抗與重組EDⅢ免疫方式的關系，加深了對EDⅢ亞單位疫苗免疫策略的認識，為后續(xù)改進基于EDⅢ的疫苗免疫方案提供了依據(jù)。
　　 第三部分建立簡易、高通量的方法評價登革病毒抗體的功能
　　 開發(fā)登革疫苗需要盡可能減少潛在的ADE風險，從而要求針對DENV的4個血清型獲得均衡的保護性抗體反應。在缺乏合適的登革疾病動物模型的情況下，有必要開

19、發(fā)簡單、可靠且高通量的方法用于評價登革熱疾病的風險和疫苗的安全性。
　　 在本部分研究中，我們采用表達Fcγ受體的K562細胞株和已知具有增強活性的單抗，創(chuàng)新性地建立了通過“NS1抗原捕獲ELISA”檢測培養(yǎng)上清中NS1抗原的簡單高通量的登革抗體的ADE檢測方法（ELISA-ADE方法）。為評價該方法，我們同時采用2種方法（即新建立的NS1抗原定量方法和傳統(tǒng)的病毒滴度測定方法）檢測抗體的ADE活性。發(fā)現(xiàn)兩種方法的動力學相當，線性

20、相關分析證明，這2種方法具有很好的一致性(R=0.938，P=0.000)。隨后，我們還采用同為96孔板檢測和讀板的ELISA-ADE法和已經建立的ELISPOT-MNT微中和試驗評價2株黃病毒交叉反應鼠單抗（4G2和2A10G6）和4份DENV-1感染患者的恢復期血清的增強活性和中和抗體活性。結果表明，新方法可獲得特征性的劑量反應ADE圖譜，而且增強效應發(fā)生在亞中和濃度，ADE效應與經ELISPOT-MNT測定獲得的中和效應具有合理的

21、相互關系。
　　 本研究新建立的簡單高通量的ELISA-ADE法和已建立ELISPOT-MNT檢測方法對DENV的增強和中和抗體活性的功能性評價非常有價值。它們能在大規(guī)模研究中進行DENV疫苗的安全性和有效性的評價，同時加速闡明疫苗免疫和登革疾病進展過程中的疾病風險及相關機制。
　　 小結:
　　 通過以上三個部分的研究，本課題在以下三個方面取得研究成果和創(chuàng)新:
　　 一、本研究詳細通過詳細鑒定，明確了重

22、組EDⅢ免疫制備的107株單抗中的94株針對不同血清型的結合特異性及交叉反應性。隨后，我們借助已建立的ELISPOT-MNT微中和試驗對以上單抗進行體外保護性測定。42株DENV TS單抗中，有約一半對單一血清型DENV顯示較強的中和活性，26株sCR單抗中約1/3及23株CR單抗中約2/3對不同血清型DENV表現(xiàn)出強、中等或弱的復雜活性譜。我們通過重組EDⅢ蛋白與天然病毒粒子表面EDⅢ蛋白的構象性差異，合理地解釋了單抗的結合能力與體外

23、中和能力方面的不一致。通過以上研究，我們獲得了有價值的強中和活性單抗（如本實驗室其它研究者進行的3E31、2D73等單抗的晶體結構與功能研究），為后續(xù)EDⅢ單抗的抗原性位點鑒定、深入的結構研究、全面的功能測定和治療性單抗的研究奠定了良好的基礎。
　　 二、本部分研究在以上研究定基礎上，對94單抗的抗原性位點進行詳細的鑒定。通過合成重疊多肽掃描分析、序列比對、氨基酸替換分析等，我們發(fā)現(xiàn)23株CR單抗中有15株（約占2/3）特異性地

24、識別相同的高度保守且免疫優(yōu)勢的DENV復合體表位（aa310-319序列），這是我們首次發(fā)現(xiàn)CR單抗識別這一表位具有免疫優(yōu)勢。我們繼續(xù)采用位點定向突變和酵母表面展示分析，發(fā)現(xiàn)該表位的關鍵殘基定位于AB loop上的Q316和H317。結合三維建模分析，我們認為，重組EDⅢ作為免疫原可誘導產生針對在病毒粒子表面表位不暴露的單抗，這些單抗對EDⅢ的結合能力強但中和活性較弱，合理地解釋了定位至ABloop弱中和活性的交叉反應單抗與重組EDⅢ免

25、疫方式的關系，加深了對EDⅢ亞單位疫苗免疫策略的認識，為后續(xù)改進基于EDⅢ的疫苗免疫方案提供了依據(jù)。
　　 三、在本部分研究中，我們用表達Fcγ受體的K562細胞株和已知具有增強活性的單抗，在國內外首次創(chuàng)新性地建立了通過NS1抗原捕獲ELISA定量檢測培養(yǎng)上清中NS1抗原的ADE檢測方法（ELISA-ADE方法），可對登革抗體的增強活性進行簡單、快速、高通量的檢測，同時避免了其它方法繁瑣、費時的檢測程序及對復雜儀器的要求。我們首