他汀類藥物與抗氧化藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)全身性的病理過程，可導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄甚至閉塞，是造成心肌梗死、腦卒中和周圍血管慢性缺血性疾病的首要病因。經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)與支架植入術(shù)是目前治療動(dòng)脈狹窄/閉塞性疾病的常用方法，然而，術(shù)后數(shù)月內(nèi)血管往往會(huì)再狹窄甚至再閉塞，因此其遠(yuǎn)期療效仍然未盡如人意。
　　血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的異常增殖和遷移被認(rèn)為與動(dòng)脈粥樣硬化和支架植入術(shù)后再狹窄有關(guān)，而表型轉(zhuǎn)換是活化的VSMC發(fā)生上述生物學(xué)行為改變的基礎(chǔ)。因此，預(yù)防和延緩VS

2、MC的異常增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化和支架術(shù)后再狹窄意義重大。
　　臨床上，他汀類藥物和抗氧化藥物常用于防治上述疾病。他汀類藥物通過抑制VSMC增殖并從誘導(dǎo)其凋亡，可抑制血管成形術(shù)后內(nèi)膜增生，故除用于降低血脂外，已作為一種抑制內(nèi)膜增生的藥物廣泛應(yīng)用于臨床。而普羅布考等抗氧化藥物是一種新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物，與VSMC的生物學(xué)行為的關(guān)系目前仍未完全明確，因此有必要探明他汀類藥物和普羅布考對(duì)其生物學(xué)行為的影響，并比較兩

3、者的異同。
　　本課題將使用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)分別誘導(dǎo)大鼠VSMC發(fā)生增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，其后給予不同濃度的阿托伐他汀、普羅布考或兩者聯(lián)用，觀察這兩種藥物對(duì)VSMC上述生物學(xué)行為的影響，并比較兩者單用及聯(lián)用時(shí)效應(yīng)的異同和強(qiáng)弱，為今后臨床用藥提供依據(jù)和參考方案。
　　第一部分血管平滑肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　目的
　　從健康雄性SD大鼠胸腹主動(dòng)脈中分離、培養(yǎng)及鑒定中膜VSMC，建立簡(jiǎn)單有效的原代VSMC

4、培養(yǎng)體系。
　　方法
　　無菌條件下取出健康雄性SD大鼠胸腹主動(dòng)脈，去除外膜及內(nèi)膜后，采用組織貼塊法分離和培養(yǎng)中膜VSMC，并適時(shí)傳代、凍存和復(fù)蘇。通過倒置顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞純度。
　　結(jié)果
　　在貼塊后4d-7d，原代細(xì)胞從小組織塊周圍萌出，隨后的10d-14d細(xì)胞逐漸遷出和生長(zhǎng)，最終融合成致密的細(xì)胞層，從貼塊到原代細(xì)胞傳代的時(shí)間為2w-3w。多數(shù)原代V

5、SMC表現(xiàn)為典型的長(zhǎng)梭形或三角形，胞漿豐富，生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)呈現(xiàn)出“峰谷”樣排列，傳代后的VSMC形態(tài)和排列與原代細(xì)胞保持一致。臺(tái)盼藍(lán)染色示細(xì)胞活力為96.3％±1.8％。SMα-Actin染色陽性的VSMC百分比為95.4％±2.7％。
　　結(jié)論
　　通過組織貼塊法，可在體外成功分離獲得正常大鼠主動(dòng)脈中膜VSMC，其中絕大多數(shù)是收縮型細(xì)胞，而且活力好，純度高，可用于研究VSMC的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等生物學(xué)行為。
　

6、　第二部分他汀類藥物與抗氧化藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對(duì)VSMC增殖的影響，評(píng)估兩者單用及聯(lián)用時(shí)的影響程度差異，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定阿托伐他汀和普羅布考的最佳作用濃度。
　　方法
　　用MTT比色法評(píng)估阿托伐他汀在0.1μmol/L-10μmol/L、普羅布考在1μmol/L-100μmol/L的濃度范圍內(nèi)，分別單用和聯(lián)用時(shí)的細(xì)胞毒性。以oxLDL刺激VSMC，在上述

7、濃度下分別單用和聯(lián)用阿托伐他汀和普羅布考，比較各組VSMC的吸光值。
　　結(jié)果
　　在上述濃度下，阿托伐他汀(P=0.214)、普羅布考（P=0.547）和兩藥聯(lián)用（P=0.999）對(duì)VSMC沒有細(xì)胞毒性作用。oxLDL能誘導(dǎo)VSMC增殖，使吸光度升高，而單用普羅布考(P＜0.001)和兩藥聯(lián)用（P=0.001）可降低VSMC吸光值。阿托伐他汀和普羅布考分別在10μmol/L和100μmol/L時(shí)，對(duì)VSMC的作用最顯著。<

8、br>　　結(jié)論
　　單用普羅布考及聯(lián)用阿托伐他汀與普羅布考均可顯著抑制VSMC的增殖，且這一抑制作用是劑量依賴性的。單用阿托伐他汀能否抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC增殖活動(dòng)，需要更大樣本量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　第三部分他汀類藥物與抗氧化藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對(duì)VSMC遷移的影響，并評(píng)估兩者單用及聯(lián)用時(shí)的影響程度差異。
　　方法
　　以oxLDL刺激VSMC后

9、，分別單用和聯(lián)用阿托伐他汀(10μmol/L)和普羅布考(100μmol/L)，其后在熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組、oxLDL組、阿托伐他汀組、普羅布考組和阿托伐他汀+普羅布考組VSMC的遷移情況，并拍照記錄，計(jì)算各照片中VSMC遷移進(jìn)入刮除區(qū)后在刮除區(qū)所占的面積百分比，以進(jìn)行細(xì)胞平面遷移分析。
　　結(jié)果
　　對(duì)照組遷移VSMC占細(xì)胞刮除區(qū)內(nèi)面積的百分比為5.80％±2.85％，oxLDL組為17.42％±9.97％，阿托伐他汀組

10、為9.68％±2.65％，普羅布考組為11.84％±5.14％，阿托伐他汀+普羅布考組為5.28％±2.24％。對(duì)照組與oxLDL組之間（P=0.004）及阿托伐他汀+普羅布考組與oxLDL組之間(P=0.002)有顯著性差異，其余各對(duì)比較無顯著性差異。
　　結(jié)論
　　聯(lián)用阿托伐他汀和普羅布考可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的VSMC的遷移行為。大樣本量的研究或可證明單用阿托伐他汀和單用普羅布考是否確能抑制VSMC發(fā)生遷移。

11、　　第四部分他汀類藥物與抗氧化藥物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響
　　目的
　　觀察他汀類藥物和抗氧化藥物對(duì)VSMC表型轉(zhuǎn)換的影響，并評(píng)估兩者單用及聯(lián)用時(shí)的影響程度差異。
　　方法
　　以oxLDL刺激VSMC，其后分別使用10μmol/L阿托伐他汀、100μmol/L普羅布考和10μmol/L阿托伐他汀+100μmol/L普羅布考，通過透射電子顯微鏡觀察各組VSMC的形態(tài)，免疫組織化學(xué)、Western Blot

12、和Real time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞的VSMC表型蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　與對(duì)照組相比，oxLDL組VSMC肌絲大量減少甚至消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器增多和擴(kuò)張，線粒體也增多;阿托伐他汀組、普羅布考組和阿托伐他汀+普羅布考組VSMC的肌絲多于oxLDL組但少于對(duì)照組，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則少于oxLDL組VSMC。oxLDL組VSMC的SMα-Actin、SM-MHC和Smoothelin的表達(dá)量在蛋白水平和