納米細(xì)菌對兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的影響和機(jī)制探討.pdf

1、第一部分動脈粥樣硬化斑塊中納米細(xì)菌的培養(yǎng)與鑒定。 目的：研究動脈粥樣硬化斑塊中是否存在納米細(xì)菌，并對其進(jìn)行鑒定。 方法：將手術(shù)中采獲的12例動脈粥樣硬化斑塊及12例正常動脈血管組織研磨，取上清液培養(yǎng)。培養(yǎng)8周后收集培養(yǎng)瓶底的白色粉末，用納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法對其進(jìn)行鑒定，并利用電鏡進(jìn)一步觀察其形狀。對收獲的納米細(xì)菌進(jìn)行再培養(yǎng)，每周檢測一次培養(yǎng)基上清液K<'+>、Na<'+>、Cr<'->、Mg<'2+>、Ca<

2、'2+>、P<'3->及葡萄糖的濃度。 結(jié)果：12 例動脈粥樣硬化斑塊中10例納米細(xì)菌檢測陽性，2 例陰性，12例正常動脈血管組織中1例納米細(xì)菌檢測陽性，11例陰性，卡方檢驗(yàn)存在顯著性差異(P<0.05)。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法檢測時，納米細(xì)菌可發(fā)出綠色熒光，透射電鏡下測量納米細(xì)菌直徑大小約為100～300nm。培養(yǎng)過程中上清液的K<'+>、Na<'+>、Cr<'->、Mg<'2+>及葡萄糖的濃度無明顯變化(P>0.0

3、5)；而Ca<'2+>、P<'3->濃度進(jìn)行性下降，每周檢測結(jié)果比較存在顯著性差異(P<0.05)。 結(jié)論：動脈粥樣硬化斑塊中存在納米細(xì)菌，它可能導(dǎo)致粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法可以幫助鑒定納米細(xì)菌。納米細(xì)菌在培養(yǎng)過程中消耗Ca<'2+>、P<'3->而不利用K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、Mg<'2+>及葡萄糖。 第二部分納米細(xì)菌對免主動脈血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的影響。 目的：

4、觀察納米細(xì)菌對兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞是否具有損傷作用及鹽酸四環(huán)素干預(yù)能否減輕這種損傷。 方法：光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌攻擊及1.95μg/ml 鹽酸四環(huán)素干預(yù)48h和72h后的兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度納米細(xì)菌攻擊和1.95μg/ml鹽酸四環(huán)素干預(yù)48h和72h后的平滑肌細(xì)胞存活和增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測不同濃度納米細(xì)菌攻擊和 1.95μg/ml鹽酸四環(huán)素干預(yù)24h后的平滑肌細(xì)胞凋亡

5、情況。 結(jié)果：不同濃度納米細(xì)菌攻擊后血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)存在不同程度改變，極低濃度時(OD=0.001，0.005)無明顯變化，隨濃度增加和時間延長，平滑肌細(xì)胞逐漸出現(xiàn)空泡樣變，輪廓不清，細(xì)胞膜損傷破裂，嚴(yán)重時血管平滑肌細(xì)胞被完全破壞。鹽酸四環(huán)素干預(yù)后發(fā)現(xiàn)極低濃度(OD=0.001，0.005)和低濃度(OD=0.01，0.03,0.05)的納米細(xì)菌攻擊對血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯影響，但高濃度納米細(xì)菌(OD=0.1，0.3)仍可

6、導(dǎo)致大部分平滑肌細(xì)胞損傷和壞死。不同濃度納米細(xì)菌攻擊48h后：除OD=0.001組外各濃度組MTT值低于對照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，各濃度組MTT值之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。攻擊72h后：各濃度組MTT值均低于對照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，OD=0.1組和OD=0.3組的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)，其余各濃度組之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。每一濃度納米細(xì)菌攻擊4

7、8h和72h后：OD=0.001，0.005時72h的MTT值高于48h的MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)。OD=0.01，0.03，0.05，0.1時72h的MTT值低于48h的MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)。OD=0.3時48h的MTT值和72h的MTT值比較無顯著性差異。鹽酸四環(huán)素干預(yù)48h及72h后：納米細(xì)菌(OD=0.001，0.005，0.01，0.03，0.05，0.1)攻擊后的平滑肌細(xì)胞MTT值低于鹽酸

8、四環(huán)素干預(yù)后MTT值，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較存在顯著性差異(P<0.05)。納米細(xì)菌(OD=0.3)攻擊后的血管平滑肌細(xì)胞MTT值與鹽酸四環(huán)素千預(yù)后MTT值比較未見顯著性差異(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：不同濃度納米細(xì)菌攻擊24h后，未見明顯血管平滑肌細(xì)胞凋亡，鹽酸四環(huán)素干預(yù)后各濃度組也未見明顯細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：納米細(xì)菌可以損傷兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞，濃度越高，攻擊時間越長，損傷程度越重；短時間內(nèi)(24小時)被納米細(xì)菌攻擊的血管平滑

9、肌細(xì)胞的死亡方式是壞死而不是凋亡；鹽酸四環(huán)素可以減輕納米細(xì)菌對血管平滑肌細(xì)胞的損傷。 第三部分納米細(xì)菌損傷兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞機(jī)制的初步探討。 目的：從自由基的角度初步探討納米細(xì)菌對兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞的損傷機(jī)制。 方法：0.5Mcfarland 濃度納米細(xì)菌攻擊兔主動脈血管平滑肌細(xì)胞，分別在0、12、24、48、72小時各時間點(diǎn)取培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說明檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydroge

10、nase,LDH)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)的變化。 結(jié)果：隨著攻擊時間的延長，LDH 濃度逐漸升高，與對照組比較存在顯著性差異，各時間點(diǎn)比較存在顯著性差異(P<0.05)；SOD的活性隨攻擊時間延長而逐漸升高，與對照組比較存在顯著性差異，各時間點(diǎn)比較存在顯著性差異(P<0.05)；MDA含量