超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景和目的：血管新生內(nèi)膜形成是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后再狹窄(RS)的病理基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮損傷后，中膜的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)在多種生長因子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的作用下，由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，并向內(nèi)膜下遷移，發(fā)生過度增殖則是新生內(nèi)膜形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外，介入術(shù)后早期VSMC凋亡相對(duì)不足，增殖與凋亡之間平衡失調(diào)，也是RS發(fā)生的重要機(jī)制。因此，如何有效抑制VSMC細(xì)胞增殖和遷移、調(diào)節(jié)VSMC增殖與凋亡之間的平衡，已成為RS防治的重

2、點(diǎn)。目前的防治方法主要有口服抗血小板藥、他汀類藥、抗增殖藥等藥物，血管內(nèi)放射治療，轉(zhuǎn)基因治療和藥物涂層支架，但均不能完全解決新生內(nèi)膜增生的問題。近年來，有關(guān)將超聲介導(dǎo)微泡技術(shù)引入超聲治療的研究進(jìn)展十分迅速。超聲空化效應(yīng)本身對(duì)周圍組織細(xì)胞可產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)，如抑制細(xì)胞增殖、遷移、粘附，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，這些生物學(xué)效應(yīng)可用于臨床治療的各個(gè)方面；超聲造影劑作為一種人為的空化核，不僅降低超聲的空化閾值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，并減少產(chǎn)生空化效應(yīng)所需的超聲

3、能量，還可作為攜帶藥物、蛋白和基因的載體，并利用超聲擊破微泡，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向?qū)牒歪尫?。因此，如果能將微泡造影劑的靶向載體功能和超聲空化效應(yīng)本身的生物學(xué)效應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來，將為臨床防治RS開辟一個(gè)新途徑。本研究擬制備一種包載紫杉醇的脂質(zhì)體微泡造影劑，研究超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠VSMC增殖、遷移、凋亡以及表型轉(zhuǎn)化的影響，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探討。 方法：(1)采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC。(2)通過臺(tái)盼

4、藍(lán)排斥試驗(yàn)評(píng)價(jià)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡對(duì)VSMC的安全性。(3)采用冷凍干燥法制備攜帶紫杉醇的脂質(zhì)體微泡造影劑，在光鏡和熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)和大小以及紫杉醇在微泡上的定位，用Zetasizer3000和pH計(jì)檢測(cè)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡的粒徑和粒度、表面電位、pH值，應(yīng)用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測(cè)紫杉醇的包封率，通過臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)評(píng)價(jià)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡的安全性。(4)應(yīng)用四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、millicell小室和

5、AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)染色分別檢測(cè)超聲介導(dǎo)空白脂質(zhì)體微泡和超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡對(duì)VSMC增殖、遷移和凋亡的影響。(5)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光化學(xué)、熒光細(xì)胞化學(xué)、熒光探針和激光共聚焦技術(shù)觀察超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡和超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡對(duì)VSMC的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、p27、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、Bcl-2、Bax、肌動(dòng)蛋白絲(F-actin)、紐帶蛋白(vinculin)、β-微管蛋白(β

6、-tubulin)、波形蛋白(vimentin)的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響；(6)通過RT-PCR、westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)分析超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡和超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡對(duì)VSMC表型標(biāo)志基因SMα-actin和SMemb的蛋白及mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：(1)采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光化學(xué)鑒定證實(shí)為VSMC。(2)1MHz的連續(xù)波超聲，單純超聲輻照在聲強(qiáng)

7、小于0.8W/cm2，超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡(1μl/ml)在聲強(qiáng)小于0.4W/cm2時(shí)，對(duì)VSMC無明顯的毒性作用；(3)采用冷凍干燥法成功制備載紫杉醇脂質(zhì)體微泡，其平均粒徑為2.79μm(2～10μm)，表面電位-5.9，pH值5.54，包封率為36.1±4.74％，對(duì)VSMC無毒性作用。(4)以聲強(qiáng)為0.5W/cm2的超聲輻照60s，聲強(qiáng)為0.3W/cm2的超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡輻照30s時(shí)，VSMC吸光度顯著降低(P＜0.05)，超聲介

8、導(dǎo)微泡組輻照60s時(shí)吸光度降低最大(P＜0.01)；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMC吸光度均較血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)組顯著降低(P＜0.01)；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMC吸光度明顯低于超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組(P＜0.05)。(5)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組、超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組S期細(xì)胞比例均較PDGF組顯著降低(P＜0.01)

9、，超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組G0-G1期細(xì)胞顯著增多(P＜0.01)，單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組G2-M比例顯著增高(P＜0.01)，超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組G0-G1期和G2-M期細(xì)胞比例均顯著增高(P＜0.01)；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組S期細(xì)胞比例較超聲介導(dǎo)空白脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組均顯著降低(P＜0.01)。(6)0.3W/cm2的超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡輻照60s時(shí)，VSMC遷移數(shù)顯著減少(P＜0.05)，輻照120

10、s時(shí)，VSMC遷移數(shù)減少達(dá)最大；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMC遷移數(shù)均顯著降低(P＜0.01)；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMC遷移數(shù)明顯低于超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組(P＜0.01)。(7)單純超聲輻照組和超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)VSMC凋亡，輻照時(shí)間為120s時(shí)，細(xì)胞凋亡比例達(dá)峰值，分別為10.81％和20.32％；超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組與超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組

11、之間VSMC凋亡比例無顯著差異(P＞0.05)；單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組對(duì)VSMC凋亡比例無明顯影響(P＞0.05)。(8)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組、超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組以及單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMCPCNA蛋白表達(dá)陽性率顯著降低(P＜0.01)，其中以超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組更為明顯；超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組和超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組CDK2表達(dá)減少、p27表達(dá)增高(P＜0.01)；單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組CDK2、p2

12、7表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。單純超聲輻照組、超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組和超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組VSMCBax表達(dá)顯著增高，而Bcl-2表達(dá)明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)；單純載紫杉醇微泡組Bax和Bcl-2表達(dá)無明顯變化。(9)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組，F(xiàn)-actin、vinculin表達(dá)減少，β-tubulin和vimentin解聚；超聲介導(dǎo)載紫杉醇微泡組和單純紫杉醇微泡組F-actin、vinculin、β-tubulin

13、有邊集現(xiàn)象，vimentin表達(dá)和分布無明顯改變。(10)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組、超聲介導(dǎo)載紫杉醇微泡組和單純載紫杉醇微泡組均可減輕VSMC細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載(P＜0.01)，其中以超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡組更為明顯。(11)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡組可顯著抑制VSMC合成型標(biāo)志基因SMemb蛋白及mRNA表達(dá)(P＜0.01)，并逆轉(zhuǎn)血清誘導(dǎo)的收縮型標(biāo)志基因SMα-actin蛋白及mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)；單純載紫杉醇微泡組SMem

14、b和SMα-actin蛋白及mRNA的表達(dá)無明顯變化(P＞0.05)。 結(jié)論：(1)用冷凍干燥法成功制備了表面帶負(fù)電荷的載紫杉醇脂質(zhì)體微泡超聲造影劑，粒徑大小符合靜脈注射要求，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí)了該超聲造影劑的安全性。(2)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡、超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡和單純載紫杉醇脂質(zhì)體微泡均可明顯抑制PDGF-BB所致的VSMC增殖、遷移，其中以超聲介導(dǎo)載紫杉醇脂質(zhì)體微泡的作用最為顯著。(3)超聲介導(dǎo)脂質(zhì)體微泡、超聲介導(dǎo)載