人胰腺干細胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的人類第三大疾病。目前糖尿病患者多采用外源胰島素來控制血糖水平，但是不可避免會產(chǎn)生低血糖癥狀。近年來，胰島移植已經(jīng)發(fā)展成為有望嚴格控制血糖水平的糖尿病治療方法。由于供體胰腺的短缺，人們開始尋找胰島的替代資源，如干細胞、豬胰島等。胰腺干細胞是存在于胰腺組織中、能自我更新、具有多向分化潛能的一類成體干細胞。胰腺干細胞體外增殖分化為胰島細胞的途徑具有方法簡便、成功率高、致瘤風(fēng)險小和無倫理因素制約等優(yōu)勢，有望率

2、先用于治療糖尿病。 本實驗室于2004年建立一株人胰腺干細胞系，但對其生物學(xué)特性僅進行了初步檢測。本研究以該胰腺干細胞為試驗材料，對其表達特征、生長特性、體內(nèi)外分化能力進行了較為系統(tǒng)的鑒定，以進一步完善其生物學(xué)特性的檢測；同時將其體外定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞團并植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)，觀察其改善糖尿病癥狀的效果，旨在為糖尿病的臨床治療研究提供一株背景清楚的種子細胞。本研究主要內(nèi)容包括： 1 人胰腺干細胞的生物學(xué)特性免疫組

3、化染色結(jié)果顯示，該胰腺干細胞表達PDX-1、Nestin、CK7、CK19、胰高血糖素、生長抑素、胰多肽、GLUT2、E-鈣黏素、波形蛋白、AFP和PCNA，不表達胰島素和胰淀素；RT-PCR進一步證實細胞轉(zhuǎn)錄PDX-1、Nestin、CK7、CK19、GLUT2和β-Gal基因，不轉(zhuǎn)錄胰島素基因；流式細胞儀分析顯示，該胰腺干細胞表達CD29、CD44、CD166，不表達CD14、CD34、CD45、CD11a、CD90、CD105、C

4、D117。該胰腺干細胞與目前所報道的胰腺干細胞的表達特征基本一致。 該胰腺干細胞呈克隆性生長。當(dāng)培養(yǎng)皿中細胞數(shù)較少時，可見多角形的上皮樣胰腺干細胞呈典型的單克隆方式生長；當(dāng)細胞生長至70％融合時，則呈鋪路石樣。接種培養(yǎng)1～4d，細胞生長緩慢處于潛伏期；5～7d，進入對數(shù)生長期；之后生長速度減慢進入平臺期。與第30、44代細胞相比，第20代細胞從第6d起生長較快。目前此胰腺干細胞已擴增培養(yǎng)3年。 該胰腺干細胞植入裸鼠體內(nèi)后

5、，在其腹股溝處形成腫塊。移植后6周，取腫塊做切片。H．E染色，可見細胞在裸鼠體內(nèi)分化形成的組織含有未成熟的腺泡樣結(jié)構(gòu)，而組織部分區(qū)域可見壞死細胞，可能是營養(yǎng)缺乏所致。結(jié)合PDX-1、Nesfin、CK19免疫組化染色陽性結(jié)果，提示該胰腺干細胞在體內(nèi)可自發(fā)分化為胰腺來源的細胞。體外采用添加煙酰胺、bFGF與HGF的無血清誘導(dǎo)液誘導(dǎo)干細胞分化為DTZ染色陽性的β細胞；采用β-Me誘導(dǎo)其分化為β-tublin免疫組化染色陽性的神經(jīng)細胞；采用地

6、塞米松和Vc誘導(dǎo)其分化為甲苯胺藍染色陽性的軟骨細胞；但是應(yīng)用5-氮胞苷并未將干細胞誘導(dǎo)分化為心肌細胞，提示可能是該誘導(dǎo)條件不適合其向心肌方向分化或該胰腺干細胞分化能力有限。綜上，該胰腺干細胞體內(nèi)可自發(fā)分化為胰腺來源的細胞，體外可定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層的胰腺β細胞、中胚層的軟骨細胞及外胚層的神經(jīng)細胞，表明其具備多向分化潛能。 2 人胰腺干細胞誘導(dǎo)胰島樣細胞團及其治療大鼠糖尿病采用無血清誘導(dǎo)液將隨機解凍的第18代人胰腺干細胞體外誘導(dǎo)分化為胰島

7、樣細胞團，DTZ染色陽性，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄胰島素mRNA，葡萄糖刺激能釋放胰島素。將獲得的胰島樣細胞團植入STZ制備的糖尿病大鼠腎背膜下，移植后48h，血糖水平即明顯下降，維持約兩周時間，但其血糖濃度仍高于正常血糖濃度范圍；移植后第3周血糖濃度迅速上升，之后一直維持高血糖狀態(tài)。與胰島樣細胞團移植組大鼠相比，糖尿病對照組大鼠血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(nèi)。初步證實人胰腺干細胞體外誘導(dǎo)分化的胰島樣細胞團具有一定的抗大鼠糖尿病作用。