靶向OPN基因的RNA干擾對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　 第一部分 RNA干擾OPN基因的慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:構(gòu)建并制備攜帶靶向shRNA-OPN基因的慢病毒載體。
　　 方法:根據(jù)OPN的基因序列設(shè)計(jì)四條siRNA作為RNA干擾靶點(diǎn)，分別構(gòu)建4個(gè)shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體并通過(guò)PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定正確后分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。選取最

2、有效的靶點(diǎn)包裝OPN-RNAi慢病毒。對(duì)所獲病毒載體進(jìn)行鑒定分析和滴度測(cè)定。
　　 結(jié)果:構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)PCR鑒定均可擴(kuò)增出預(yù)期條帶，測(cè)序證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。Western blot顯示KD1，KD2，KD3，KD4靶點(diǎn)對(duì)目的基因的表達(dá)都有顯著敲減作用，逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定shRNA-OPN病毒滴度約為2×109TU/ml。
　　 結(jié)論:成功制備了OPN-shRNA慢病毒載體。
　　 第二部分 OPN-sh

3、RNA對(duì)人膀胱癌（T24細(xì)胞）生物學(xué)行為影響的體外研究
　　 目的:觀察由慢病毒攜帶的OPN-shRNA對(duì)體外培養(yǎng)的人膀胱癌的抑制作用。
　　 方法:將OPN-shRNA轉(zhuǎn)染入人膀胱癌T24細(xì)胞株中，并測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。PCR、Western blot檢測(cè)OPN mRNA和蛋白表達(dá)，MTT法檢測(cè)干擾組（OPN-RNAi組）增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期，Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室

4、檢測(cè)其侵襲能力。
　　 結(jié)果:OPN-shRNA被成功地轉(zhuǎn)染入T24細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率在90％以上。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，干擾組（實(shí)驗(yàn)組）OPN細(xì)胞的mRNA表達(dá)明顯受到抑制，同樣的結(jié)果見(jiàn)于蛋白表達(dá)的檢測(cè)中。同時(shí)，干擾組細(xì)胞增殖能力下降，凋亡率增高、侵襲能力下降。
　　 結(jié)論:在體外，OPN-shRNA能抑制人膀胱癌T24細(xì)胞株的OPN基因表達(dá)，并能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 第三部分

5、 OPN-shRNA對(duì)人膀胱癌(T24細(xì)胞)生物學(xué)行為影響的體內(nèi)研究
　　 目的:在整體水平研究OPN-shRNA對(duì)T24生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)行為的抑制作用。
　　 方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤模型。在皮下模型中，按500ug標(biāo)準(zhǔn)在瘤內(nèi)分別注射OPN-shRNA，陰性對(duì)照shRNA病毒，等量生理鹽水觀察抑瘤效果，S-P法檢測(cè)OPN、VEGF蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:干擾組皮下移植瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，體積和重量明顯小于