膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞體外分離培養(yǎng)鑒定及生物學特性研究.pdf

1、腦腫瘤是嚴重威脅人類生命和健康的疾病之一，目前尚缺乏有效的治療方法，預(yù)后較差。腫瘤干細胞學說的提出，為進一步理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展乃至復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機制提供了一條全新的途徑。根據(jù)腫瘤干細胞學說，腫瘤干細胞是在腫瘤組織中存在的、少數(shù)具有不定增殖潛能的一類細胞，它可驅(qū)使腫瘤的形成和生長，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用，因此腫瘤干細胞可以說是腫瘤的種子和源泉，對其生物學特征及基因、信號傳導(dǎo)機制的研究，將有助于從源頭上殺傷腫瘤細胞、治愈腫瘤。

2、近年來研究表明：神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)可能是腦腫瘤干細胞的主要來源。本研究正是基于這一理念，根據(jù)國內(nèi)外的研究資料，采用神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)技術(shù)和改良的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，從高度惡性的膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)中分離培養(yǎng)腫瘤干細胞，并從染色體異常的角度出發(fā)，探求其基因組學的變異。最后在體外條件下觀察其生物學特性和分化特點。 第一部分膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞體外的分離、培養(yǎng)和純化

3、 目的：探討GBM腫瘤干細胞的分離、培養(yǎng)和純化的方法。 方法：應(yīng)用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)技術(shù)和改良神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，在11例GBM中，懸浮培養(yǎng)GBM的腫瘤細胞。采用有限稀釋法，篩選分離具有連續(xù)克隆能力的單細胞。選擇Nestin對其進行標記，利用流式細胞儀檢測原代培養(yǎng)的細胞中Nestin+細胞的比例，以及克隆擴增后Nestin+細胞的比例。 結(jié)果：本組11例GBM樣本，除1例在培養(yǎng)過程中發(fā)生細菌污染外，其余l(xiāng)O例在體外培養(yǎng)的條

4、件下，均獲得了具有連續(xù)克隆及增殖能力、具有干細胞特征的腫瘤細胞。在有限稀釋克隆分選的過程中，能更為特征性的觀察到這一過程。而且在原代培養(yǎng)過程中，具有克隆能力的細胞表達Nestin+的比例為6.23％～40.28％，克隆分選后Nestin+的細胞比例顯著增加，達到74.46-82.14％。 結(jié)論：GBM中存在著一類比例較少的、具有自我更新和增殖潛能并表達Nestin+、具有干細胞特征的腫瘤細胞，在體外可將其分離、培養(yǎng)和純化。

5、 第二部分 目的：探討GBM來源的腫瘤干細胞的分化特征，并就其干細胞源性進行鑒定，為腦腫瘤干細胞的進一步研究打下基礎(chǔ)。 方法：采用克隆分選后具有連續(xù)克隆及增殖能力的腫瘤細胞為研究對象，通過免疫組化的方法檢測其干細胞的表面標志Nestin、CD133的表達情況，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察其內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特點，確定其干細胞的特征；再通過核型分析的方法探討此種干細胞是否存在染色體的異常，確定其腫瘤性；最后，將通過鑒定的腫瘤干細胞

6、接種于不含生長因子的無血清培養(yǎng)基，觀察其在體外條件下的分化特點。 結(jié)果：本組10例樣本在免疫組化檢測中均同時表達CD133、Nestin陽性；在掃描電子顯微鏡下，可見腫瘤細胞球由眾多的球形細胞組成，細胞表面分布有短而細的絨毛，保持細胞間的接觸，中心部位細胞排列緊密，周邊部位排列疏松，部分細胞表面發(fā)出豐富的膠質(zhì)絲樣突起，腫瘤球邊緣有細胞爬出；透射電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤球內(nèi)的細胞呈明顯的不均一性，多數(shù)細胞體積較大、細胞器不發(fā)達；核型分