人乳腺腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定及低氧對(duì)乳腺腫瘤干細(xì)胞特性影響的研究.pdf

1、乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤,屬高發(fā)病、高死亡率疾病。腫瘤術(shù)后出現(xiàn)較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,同時(shí)伴有對(duì)放化療的抗藥性是其高死亡率的原因之一。近年來腫瘤干細(xì)胞理論的提出突破了以往對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí),認(rèn)為腫瘤的發(fā)生以及對(duì)放化療的抗藥性源于腫瘤組織中的腫瘤干細(xì)胞。這一腫瘤發(fā)生的模型很好的解釋了腫瘤治療失敗的原因,也從細(xì)胞學(xué)的角度提出了腫瘤研究和治療的靶點(diǎn),為臨床根治腫瘤提供了理論依據(jù)。
　　為此本研究擬從原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中獲得能持續(xù)傳代的

2、腫瘤干細(xì)胞克隆,體外培養(yǎng)鑒定其自我更新能力,明確其表面標(biāo)志物。觀察該細(xì)胞對(duì)低氧微環(huán)境的敏感性,并對(duì)乳腺腫瘤干細(xì)胞的低氧微環(huán)境進(jìn)行初步的探索。希望為臨床乳腺腫瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為乳腺腫瘤的診斷和治療提供新的思路。
　　第一章人乳腺腫瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)乳腺腫瘤干細(xì)胞,并鑒定其生物學(xué)特性。方法：收集臨床術(shù)后乳腺癌患者的腫瘤組織,經(jīng)機(jī)械剪切聯(lián)合酶消化法獲得腫瘤細(xì)胞并培養(yǎng),流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原

3、,MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)鑒定細(xì)胞Sox2、Nanog等基因表達(dá),免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞特異性蛋白Bcl-2、孕激素受體(PR)、VEGF、KI-67、E-cadherin的表達(dá)。結(jié)果：所獲得的細(xì)胞呈克隆球樣形態(tài)生長(zhǎng),鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有CD44+/CD24-表型,該細(xì)胞高表達(dá)Sox2、Nanog基因,且Bcl-2、PR、VEGF、KI-67、E-cadherin蛋白均陽性表達(dá);結(jié)論：人乳腺腫瘤組織中存在具有自我

4、更新和增殖能力、表達(dá)CD44+/CD24-的乳腺腫瘤干細(xì)胞,并能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。
　　第二章低氧與常氧培養(yǎng)條件下腫瘤干細(xì)胞特性影響比較實(shí)驗(yàn)
　　目的：對(duì)第一部分實(shí)驗(yàn)鑒定獲得的乳腺腫瘤干細(xì)胞在低氧條件環(huán)境培養(yǎng)及正常條件環(huán)境培養(yǎng)觀察兩種條件下乳腺腫瘤干細(xì)胞特性表達(dá)差異研究。方法：在不同的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)鑒定不同條件下乳腺腫瘤干細(xì)胞表面抗原表達(dá),MTT比色法檢測(cè)不同條件下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)鑒定