三羧酸循環(huán)蛋白復合物的鑒定.pdf

1、三羧酸循環(huán)是生物體普遍存在的一種產(chǎn)能方式，線粒體作為能量工廠正是依賴于三羧酸循環(huán)的效能。經(jīng)典的三羧酸循環(huán)包括8步反應，由8種酶催化，分別是檸檬酸合酶(Citrate Synthase，CS)、順烏頭酸酶(Aconitase，ACO)、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate Dehydrogenase，IDH)、α-酮戊二酸脫氫酶(2-Oxoglutarate DehydrogenaseComplex，OGDC)、琥珀酰輔酶A合成酶(Suc

2、cinyl-CoA Synthetase，SCS)、琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase，SDH)、延胡索酸水合酶(Fumarase，F(xiàn)H)和蘋果酸脫氫酶(Malate Dehydrogenase，MDH)。早期，人們對三羧酸循環(huán)的認識限于單一酶的作用，即每種酶僅催化一步反應。隨著科學的發(fā)展，人們認識到連續(xù)反應的兩種酶或多種酶可能存在相互作用的關系。通過提高每種酶的配比，可能提高酶的效率。早期的工作通過研究三羧酸

3、循環(huán)酶與酶之間的相互作用以提高酶的活性，從而提高微生物發(fā)酵的效率，而缺乏在哺乳動物中對三羧酸循環(huán)蛋白相互作用的研究。在本課題中，我們利用免疫共沉淀結合質(zhì)譜的方法在哺乳動物中探索三羧酸循環(huán)蛋白復合物的構成，首次發(fā)現(xiàn)哺乳動物三羧酸循環(huán)的8種酶能形成蛋白復合物，以ACO2-IDH2-MDH2-CS為核心蛋白復合物，并包含一些電子傳遞鏈(NDUFS1，ATP5B)、脂肪酸氧化(ACAA2)、氨基酸代謝(GOT2)和糖酵解的酶(GAPDH)。同時

4、我們首次發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)具有組織特異性，且在擴張型心肌病中三羧酸循環(huán)復合物的結構發(fā)生明顯的變化。
　　第一章:FH與SDHA抗體制備
　　為了研究三羧酸循環(huán)的蛋白復合物的結構，我們通過體外構建，原核克隆表達，蛋白純化等分子生物學技術，表達和純化了人源FH和琥珀酸脫氫酶黃素蛋白亞基(succinate dehydrogenase complex,subunitA,flavoprotein variant,SDHA)的抗原，并制備

5、了相應的抗體，用于免疫共沉淀和質(zhì)譜實驗。體外構建了pMAL-c5x/FH，pMAL-c5x/SDHA載體，經(jīng)轉化至大腸桿菌DE3感受態(tài)細胞中，表達并純化了FH和SDHA抗原，通過免疫動物（小鼠和兔）獲得抗血清，經(jīng)IgG純化獲得抗體，通過免疫共沉淀，免疫印跡，免疫熒光等實驗以檢測抗體的功能，結果表明制備的FH和SDHA抗體具有免疫共沉淀，免疫印跡，免疫熒光等性能，且這兩種人源蛋白制備的抗體能與多個物種的相應蛋白交叉反應，如人，大鼠，小鼠，

6、豬。
　　第二章三羧酸循環(huán)復合物的研究
　　利用制備的FH和SDHA抗體，及ACO2，IDH2，MDH2，CS，DLST，SDHB等抗體探索三羧酸循環(huán)酶復合物的組成和八種酶的蛋白相互作用，以及電子傳遞鏈NDUFS1，ATP5B，氨基酸代謝GOT2，脂肪酸氧化ACAA2和糖分解GAPDH這些酶的蛋白相互作用。利用IP-MS技術研究三羧酸循環(huán)酶以及與它密切相關的電子傳遞鏈，脂肪酸氧化，氨基酸代謝和糖分解酶的蛋白相互作用，采用we

7、stern blot驗證相互作用，蛋白質(zhì)凝膠過濾實驗探索三羧酸循環(huán)蛋白復合物的大小及酶的分布，并利用生物信息學技術構建蛋白相互作用網(wǎng)絡。結果表明三羧酸循環(huán)酶互相作用，彼此偶聯(lián)，共同形成大的分子復合物，且以ACO2-IDH2-MDH2-CS為核心蛋白復合物。蛋白質(zhì)凝膠過濾實驗也證實這四種酶在體內(nèi)形成復合物，NDUFS1，ATP5B，ACAA2，和GAPDH的IP-MS實驗也證實它們與三羧酸循環(huán)酶形成復合物。
　　第三章三羧酸循環(huán)復合

8、物的組織特異性以及與擴張型心肌病的關系研究
　　三羧酸循環(huán)復合物是具有功能的蛋白復合物，表現(xiàn)在不同的組織器官具有不一樣的蛋白復合物。正常人與擴張型心肌病患者的線粒體結構差異顯著，三羧酸循環(huán)復合物的組成有變化，并且中間產(chǎn)物的水平也表現(xiàn)出明顯的差異。利用IP-MS技術研究FH相互作用蛋白在肝臟和心臟組織中的差異，和三羧酸循環(huán)酶在不同組織如脂肪和心臟中蛋白表達的差異，以及正常心臟和擴張型心肌病心臟三羧酸循環(huán)酶復合物的不同，并利用代謝組學

9、技術探索三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的變化。結果表明FH的相互作用蛋白在肝臟和心臟出現(xiàn)顯著性差異，在肝臟中多是尿素循環(huán)相關的酶，而在心臟中則多是三羧酸循環(huán)的酶。擴張型心肌病患者心臟的三羧酸循環(huán)復合物的結構更為松散，相互之間連接不夠緊密，可能是復合物受到破壞，特別是核心復合物的結構，與此同時三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如延胡索酸，蘋果酸的水平也明顯下降。
　　第四章維藥兩色金雞菊的主要成分馬里苷對胰島素抵抗細胞的三羧酸循環(huán)復合物的影響
　　兩色金

10、雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）分布在我國湖北、廣東、陜西，新疆等地，具有降血壓，降血糖等作用。本研究探索兩色金雞菊的主要成分馬里苷對高糖誘導的胰島素抵抗的作用，并對三羧酸循環(huán)酶以及中間產(chǎn)物的影響。構建了高糖誘導的胰島素抵抗細胞模型，給以馬里苷處理，檢測細胞的糖分解能力及三羧酸循環(huán)酶的mRNA，蛋白表達差異，以及利用代謝組學技術檢測中間產(chǎn)物的變化。通過糖吸收，糖分解等指標表明成功構建了高糖誘導的胰島素抵抗細胞模