人tmTNF-α單鏈抗體的構建、表達及其生物學活性鑒定.pdf

1、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）主要是由單核巨噬細胞所產生，它有分泌型TNF-α(secretory TNF-α，sTNF-α)和跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α，tmTNF-α)兩種形式。盡管TNF-α對多種腫瘤具有殺傷作用，但大量研究證實sTNF-α可促進腫瘤生長、新生血管形成和轉移。前期工作證實乳腺癌、卵巢癌、肝癌、急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤等均有部分病例高表達tmT

2、NF-α，但是癌旁組織則不表達；tmTNF-α明顯促進腫瘤生長、轉移及抵抗凋亡。提示tmTNF-α可作為腫瘤標記物，是比較理想的腫瘤靶向治療的分子靶點。
　　目前上市的抗TNF-α抗體，如Infliximab、Adalimumab、Certolizumab pegol和Golimumab均可與兩型TNF-α結合，由于sTNF-α可消耗抗體，故限制這些抗體應用于腫瘤治療。本室前期工作篩選到針對tmTNF-α的特異性單克隆抗體，由于該

3、抗體不與sTNF-α發(fā)生交叉反應，故比現有抗體更具有優(yōu)勢用于腫瘤治療。本研究擬在tmTNF-α單克隆抗體的基礎上，制備單鏈抗體，并與HSA連接，為研制特異性免疫毒素奠定基礎。
　　主要結果如下：
　　一、pET28a-tmTNF-α-scFv質粒的構建與原核表達
　　1.構建pET28a-tmTNF-α-scFv：以人鼠嵌合抗體pIRES/C1為模板分別PCR獲得抗tmTNF-α單克隆抗體可變區(qū)基因序列VH（411bp

4、），VL（396bp），再以VH，VL為模板重疊延伸PCR獲得目的片段tmTNF-α-scFv（VH-linker-VL），插入T載體，經測序證實無誤，用EcoRI，XhoI雙酶切，插入pET28a原核表達載體，獲得pET28a-tmTNF-α-scFv重組質粒。
　　2.原核表達tmTNF-α-scFv：將pET28a-tmTNF-α-scFv重組質粒轉染BL-21中表達，經IPTG誘導5h后，可見目的蛋白表達量較高，分子量為3

5、0kD，且主要分布在包涵體。經鎳柱純化，其純度可達91.4％。
　　二、tmTNF-α單鏈抗體生物學活性鑒定
　　1. ELISA檢測證實tmTNF-α-scFv與其親本單克隆抗體一樣，可有效與tmTNF-α的NTF段結合。
　　2. FCM檢測證實tmTNF-α-scFv與其親本單克隆抗體一樣，可有效與表達tmTNF-α的Raji細胞結合，幾乎不與低表達tmTNF-α的MCF-7細胞結合。
　　上述結果提示tm

6、TNF-α-scFv保留親本抗體結合抗原的特異性。
　　三、tmTNF-α-scFv單鏈抗體與HSA的連接
　　以HSA，VH-linker-VL作為模板，重疊延伸PCR獲得HSA-VH-linker-VL（即HSA-tmTNF-α-scFv）目的片段，插入T載體中，經測序證實無誤，用EcoRI，NotI雙酶切，插入酵母表達載體pPIC9K中，為后續(xù)酵母表達，并連接毒素奠定基礎。
　　結論：成功地構建和原核表達了人tm