抗CD22抗體HIB22體外生物學(xué)功能的研究及其單鏈抗體的質(zhì)粒構(gòu)建.pdf

1、初步研究小鼠源性抗CD22單克隆抗體HIB22體外的生物學(xué)功能。利用現(xiàn)有小鼠HIB22雜交瘤制備HIB22單鏈抗體(ScFv)，為進一步闡明血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機制提供有利證據(jù)，探討改進NHL靶向治療的方法。 研究方法： 本課題選用非何杰金淋巴瘤相應(yīng)細胞系及正常人周血單個核細胞(PBMN)作為研究對象，進行了以下幾方面的工作： (1)抗CD22抗體HIB22對NHL細胞系Daudi，Raji抑制增殖、促進凋亡等

2、生物學(xué)特性的影響。 (2)抗CD22抗體HIB22對常人周血細胞CD25表達，集落生長等生物功能的影響。 (3)共聚焦顯微鏡下觀察HIB22對CD22分子內(nèi)化的影響。 (4)RT-PCR的方法克隆小鼠雜交瘤HIB22的抗體基因輕、重鏈可變區(qū)基因，利用overlap-PCR方法構(gòu)建HIB22-ScFv融合基因，定向克隆入原核表達載體pET22b+，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b/HIB22-ScFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Ro

3、ssetta gami感受態(tài)菌株。 實驗結(jié)果: (1)抗CD22抗體HIB22作用于NHL細胞系Daudi，Raji，與對照組相比對其生長有明顯抑制作用，MTT法測OD值Raji(0.659VS 0.772)，Daudi(0.53VS0.64)，而對CD22表達陰性細胞系HPB-ALL的增殖無抑制(0.70VS0.69)(P值均<0.05)。 (2)抗CD22抗體HIB22與NHL細胞系Daudi共培養(yǎng)24小時后

4、與對照組相比能夠明顯誘導(dǎo)Daudi細胞的早期調(diào)亡。(HIB22組平均值32.39％VS對照組15.91％)。 (3)PWM刺激后，抗CD22抗體HIB22與正常人PBMNCs共培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，HIB22可以抑制PWM刺激的B淋巴細胞激活(CD25<'+>/CD19<'+>雙陽性細胞的比例，HIB22組平均值1.88％VSPWM刺激組3.52％)(P值均<0.05)。HIB22能夠抑制PWM引起的PBMNCs集落形成。

5、 (4)擴增HIB22重鏈可變區(qū)基因363bp，HIB22輕鏈可變區(qū)基因340bp。overlap-PCR構(gòu)建包含linker的HIB22ScFv單鏈抗體融合基因，全長為747bp，經(jīng)酶切轉(zhuǎn)入pET22b+質(zhì)粒，構(gòu)建pET22b(+)/HIB22-ScFv。 結(jié)論： (1)HIB22能夠有效抑制NHL細胞系Daudi，Raji的增殖。 (2)HIB22能夠誘導(dǎo)NHL細胞系Daudi的早期凋亡，抑制原癌基因C-