酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細胞中相互作用的蛋白質(zhì).pdf

1、後旦大學碩士學位論文學校代碼：10246學號：10211280010(專業(yè)學位)酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細胞中相互作用的蛋白質(zhì)ScreeningfortheproteinsinteractingwithStratifininhumancoloncancerstemcellsbyyeasttwohybridassays系：復旦大學附屬華東醫(yī)院業(yè)：臨床醫(yī)學(內(nèi)科學)名：宓林師：于曉峰教授導師組成員：鄒健副主任完成日期：20

2、13年4月15Et院專姓導復旦大學碩士學位論文酵母雙雜交篩選stratifin在結(jié)腸癌干細胞中相互作用的蛋白質(zhì)中文摘要背景我們在前期研究中通過比較親代結(jié)腸癌SWlll6細胞株和結(jié)腸癌干細胞株(SWlll6csc)之間的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)其中Stratifin具有顯著差異。本次實驗進一步研究Stratifin在人結(jié)腸癌干細胞中相互作用的蛋白。材料方法人結(jié)腸癌干細胞株(SWlll6csc)是本課題組前期從SWlll6細胞株中分離出并傳代培養(yǎng)

3、。我們應用CLONTECH酵母雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKERGAL4TwoHybridSystem3)，提取SWll16csc中的細胞總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄合成eDNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHIOB并構(gòu)建eDNA初級文庫，與pGADT7進行重組形成AD質(zhì)粒。將Stratifin基因利用經(jīng)PCR引入的SfiI酶切位點定向克隆至pGBKT7，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，構(gòu)建BD質(zhì)粒pGBKT7一SFN，并用卡那霉素篩選相應陽性克隆，通過酶切提取質(zhì)粒鑒

4、定插入片段的大小。將序列正確的文庫質(zhì)粒pGADT7一SWlll6csc及誘餌質(zhì)粒pGBKT7SFN共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AHl09，檢測誘餌質(zhì)粒有無毒性作用及自激活功能。通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人結(jié)腸癌干細胞eDNA文庫中與Strafitin相互作用的蛋白，篩選出His3幾acZ／Ade2陽性轉(zhuǎn)化子并進行DNA測序和BLAST比對。實驗結(jié)果構(gòu)建的pGADT7一SWI116csc文庫質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增，檢測發(fā)現(xiàn)片段長度約15Kbp左右，pGBKT

5、7一SFN經(jīng)SfiI酶切后產(chǎn)生1OKbp以上大小的片段，均與理論擴增大小一致。將酵母雙雜交系統(tǒng)中的重組誘餌載體pGBKT7一SFN與人結(jié)腸癌干細胞cDNA文庫質(zhì)粒DNA共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株AHl09，報告基因的檢測結(jié)果顯示其不具有毒性及自激活效應。利用酵母雙雜交的方法篩選出了7個與Stratifin蛋白相互作用的His3／LacZ／Ade2陽性轉(zhuǎn)化子，通過DNA測序和BLAST比對得共到了4種相關(guān)蛋白：BAD、MPRIP、CHRM】7、T