酵母雙雜交篩選環(huán)形泰勒蟲P104蛋白相互作用蛋白.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名： 巋玖聲 時(shí)間：7 曄年多月 厶日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文

2、的規(guī)定，即：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以公布( 包括刊登) 論文的全部或部分內(nèi)容。( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名： 掩。文孝 時(shí)間：沙，壚年石月／3 日導(dǎo)師簽名：二棚√時(shí)間：7 口。r 年f 月，，日酵母雙雜交篩選環(huán)形泰勒蟲P

3、1 0 4 蛋白相互作用蛋白摘要環(huán)形泰勒蟲是項(xiàng)復(fù)門的一種蜱傳性血液寄生蟲，能使牛淋巴組織增生并引起牛的熱帶泰勒蟲病，給亞洲和非洲等疾病流行地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，環(huán)形泰勒蟲主要侵染巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，能轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞不受控制的增生，并抵制其凋亡。環(huán)形泰勒蟲對(duì)宿主細(xì)胞的入侵是由一系列蛋白相繼介導(dǎo)的，其中，與真核生物溶酶體功能類似的棒狀體，作為項(xiàng)復(fù)門寄生蟲的特異性分泌器官，分泌了棒狀體一微線體蛋白p 1

4、0 4 ，該蛋白為研究環(huán)形泰勒蟲的入侵機(jī)制和對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化提供了突破口。1 ．環(huán)形泰勒蟲p 1 0 4 基因全長(zhǎng)序列的h i T A I L ．P C R 擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)采用高效熱不對(duì)稱交互P C R ( h i T A I L ．P C R ) 方法，從T a I M 細(xì)胞系的c D N A 中擴(kuò)增出了D 1 0 4 基因的側(cè)翼序列，通過拼接得到了一個(gè)p 1 0 4 基因全序列。B L A S T 分析發(fā)現(xiàn)，與報(bào)道過的環(huán)形泰勒蟲安卡拉株

5、具有9 5 ％的相似性。2 ．環(huán)形泰勒蟲p 1 0 4 蛋白的原核表達(dá)和亞細(xì)胞定位分析將環(huán)形泰勒蟲p 1 0 4 蛋白的4 7 0 —6 5 0 位殘基進(jìn)行了原核表達(dá)。將表達(dá)后的蛋白純化之后免疫家兔，制各該蛋白的多克隆抗體。利用間接免疫熒光法對(duì)p 1 0 4 蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示該蛋白主要分布于環(huán)形泰勒蟲裂殖體的表面。結(jié)果表明該蛋白適合用于研究與宿主淋巴細(xì)胞之間的相互作用。3 ．T a ⅡⅥ細(xì)胞系酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建和p

6、1 0 4 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建以T a I M 細(xì)胞系為材料，構(gòu)建了該細(xì)胞系的酵母c D N A 文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建結(jié)果顯示，該文庫(kù)庫(kù)容量達(dá)2 ．4 ×1 0 7 ，平均插入的長(zhǎng)度在1 0 0 0 b p 左右，達(dá)到試劑盒要求。通過R T - P C R 從中獲得p 1 0 4 基因片段，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒。結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組蛋白對(duì)酵母G o l d 菌株沒有自激活性和毒性作用。4 ．酵母雙雜交篩選與p 1 0 4 蛋

7、白相互作用的蛋白和相互作用蛋白的驗(yàn)證酵母雙雜交篩選出了1 4 個(gè)存在潛在相互作用的蛋白。選取最具研究?jī)r(jià)值的半乳糖凝集素( B o st a u r u sl e c t i n ，g a l a c t o s i d e - b i n d i n g ，s o l u b l e ，1 ，G a l - I ) 、熱休克蛋白7 0 ( B o si n d i c u sp a r t i a lH S P 7 0 g e n e