應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選與SARS-CoV解旋酶相互作用的細(xì)胞蛋白.pdf

1、SARS冠狀病毒(Severe Acme Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)為正鏈RNA病毒，病毒解旋酶(Helicase，HEL)對(duì)SARS-CoV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖是必不可少的。HEL的部分生物學(xué)特性已有相關(guān)的研究報(bào)道，但維持HEL活性的細(xì)胞輔助因子、HEL是否具有致病作用等尚未有研究報(bào)道。為此，本研究擬采用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)大鼠肺上皮細(xì)胞文庫(kù)進(jìn)行篩選，以期獲得與HEL相互作用的蛋

2、白質(zhì)信息，為研究HEL的作用機(jī)制提供線索。 本研究第一部分旨在排除SARS-CoV HEL的自激活作用，為后續(xù)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。為此，將pGBKT7-HEL(克隆有HEL基因的重組pGBKT7誘餌載體)轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，首先以Western Blot檢測(cè)融合蛋白，證實(shí)HEL蛋白可在AH109細(xì)胞中表達(dá)，隨后通過(guò)濾紙法定性檢測(cè)酵母胞內(nèi)β半乳糖苷酶活性證明HEL蛋白無(wú)自激活作用。 本研究第二部分將pGBKT7-

3、HEL和來(lái)源于大鼠cDNA的獵物文庫(kù)質(zhì)粒順序轉(zhuǎn)化酵母AH109細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆的挑取。隨后將順序轉(zhuǎn)化所得133個(gè)克隆通過(guò)三輪營(yíng)養(yǎng)篩選、酶切鑒定、β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)、一對(duì)一酵母雙雜交系統(tǒng)的回復(fù)性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)、測(cè)序驗(yàn)證篩除假陽(yáng)性，最后用Blast軟件進(jìn)行同源性分析研究所篩到的相關(guān)蛋白質(zhì)的信息。通過(guò)多重驗(yàn)證，最后確定7種相關(guān)蛋白，分別為Actn2(Actinin alpha 2)、Bcas2(Breast carcinom

4、a amplified sequence 2)、Thap11(Thr-His-Ala-Pro domain containing 11)、Ada(Adenosine deaminase)、Ddx5(Asp-Glu-Ala-Asp box polypeptide 5)、Dars2(Aspartyl-tRNA synthetase 2)及Smarcbl(SWI/SNF related，matrix associated，actin depe