應(yīng)用酵母雙雜交體系篩選FXR1P相互作用蛋白.pdf

1、目的:應(yīng)用酵母雙雜交體系篩選人胎腦cDNA文庫中與脆性X智力低下相關(guān)蛋白1(FXR1P)相互作用的蛋白質(zhì),進而了解FXR1P的功能,推測FXR1P與脆性X綜合征發(fā)病機制的關(guān)系。
　　方法:(1)將FXR1基因亞克隆進酵母雙雜交系統(tǒng)中的pGBKT7載體,得到誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1,轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,檢測融合蛋白對報告基因LacZ的自激活作用及對酵母菌的毒性;(2)轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH109與轉(zhuǎn)

2、化了人胎腦cDNA文庫質(zhì)粒的酵母細胞Y187進行交配,利用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和β-半乳糖苷酶濾膜分析交配混合物中報告基因ADE2、HIS3、LacZ的表達,篩選陽性克隆;(3)提取陽性克隆酵母中的質(zhì)粒DNA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,利用含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基篩選AD-Library質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子,提取AD-Library質(zhì)粒,進行酶切和歸類;(4)AD-Library質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌Y187,與轉(zhuǎn)化了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-FXR1的酵母菌AH

3、109進行交配,驗證蛋白質(zhì)的相互作用;(5)真陽性克隆的AD-Library質(zhì)粒測序及同源性分析。
　　結(jié)果:(1)酶切和測序鑒定誘餌質(zhì)粒 pGBKT7-FXR1構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,融合蛋白對報告基因LacZ無自激活作用,且對酵母菌無毒性;(2)通過文庫篩選得到77個陽性克隆;(3)AD-Library質(zhì)粒酶切后歸類獲得15組不同克隆;(4)再次驗證結(jié)果仍為陽性的克隆有10個;(5)測序結(jié)果生物學信息分析表明,7個為非