CD133+造血祖細(xì)胞對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響與探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　 大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。近年來，由于生活飲食習(xí)慣改變的原因，我國大腸癌的發(fā)病率和死亡率不斷呈逐漸上升趨勢，而侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因共同作用的復(fù)雜過程。腫瘤細(xì)胞和宿主之間的相互作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在因素，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有一定的器官傾向性，這可能是瘤細(xì)胞與特定的器官微環(huán)境相互作用相互選擇的結(jié)果

2、。腫瘤轉(zhuǎn)移取決于腫瘤細(xì)胞本身的分子特性和其分泌的因子對周圍間質(zhì)細(xì)胞的影響，包括血管、結(jié)締組織和免疫細(xì)胞等。特殊的腫瘤微環(huán)境通過各種調(diào)節(jié)機制影響著腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤轉(zhuǎn)移不只是腫瘤細(xì)胞本身的生物學(xué)特性及遺傳特性所決定，從根本上說是癌細(xì)胞與宿主相互作用的結(jié)果，宿主甚至起決定性作用。
　　 造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell)是造血組織具有自我復(fù)制和分化潛能的原始細(xì)胞。最初CD3

3、4+抗原被認(rèn)為是造血祖細(xì)胞的重要標(biāo)志，該抗原在原始造血細(xì)胞表達(dá)旺盛，后隨細(xì)胞分化而逐漸減弱。對祖細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原的初步研究發(fā)現(xiàn)，CD133+細(xì)胞較CD34+細(xì)胞具有更強的增殖潛能且包含有更高比例的長期培養(yǎng)起始細(xì)胞，在正常骨髓微環(huán)境條件下CD133+細(xì)胞可能比CD34+細(xì)胞具有更強的趨化和遷移能力，CD133+造血祖細(xì)胞可能代表了更原始的造血細(xì)胞。
　　 Kaplan RN發(fā)現(xiàn)了VEGFR1陽性造血祖細(xì)胞(vascular en

4、dothelial growthfactor receptor1 positive hematopoietic progenitor cell，VEGFR1+HPC)在動物腫瘤轉(zhuǎn)移中起到?jīng)Q定的作用，VEGFR1+HPC并非以前發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)即VEGFR2陽性造血祖細(xì)胞，而是同時具備CD133和VEGFR1兩種標(biāo)記的一種造血祖細(xì)胞，因為腹腔注射VEGFR2抗體，不能阻

5、斷VEGFR1+HPC細(xì)胞簇形成及瘤轉(zhuǎn)移灶形成，只能限制腫瘤轉(zhuǎn)移灶生長。利用β半乳糖苷酶標(biāo)記骨髓細(xì)胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型和c-myc轉(zhuǎn)基因小鼠自發(fā)性淋巴瘤模型發(fā)現(xiàn):VEGFR1+HPC首先在特定器官形成細(xì)胞簇(VEGFR1+HPC cellular clusters)，為瘤細(xì)胞準(zhǔn)備了易于形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，這些細(xì)胞簇形成部位與腫瘤轉(zhuǎn)移常見部位一致。腫瘤轉(zhuǎn)移到某種特定器官的細(xì)胞和分子機制還不是很清楚，但是很多

6、腫瘤都有轉(zhuǎn)移到某一特定器官的傾向。依靠腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞標(biāo)簽—VEGFR1+造血祖細(xì)胞在靶器官形成轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但目前的研究均采用動物受致死性輻射后進(jìn)行骨髓移植的研究方法，各器官存在輻射損傷后可能會造成非特異性骨髓動員及骨髓來源細(xì)胞的聚集，且尚未在人癌實驗層次獲得證實。
　　 臍帶血，是指胎兒出生后，殘留在臍帶和胎盤絨毛血管內(nèi)的血液。在胚胎發(fā)生過程中，32周胎齡前的胎兒循環(huán)中含有豐富的造血祖細(xì)胞，至34周齡

7、時大部分的已完成遷移，但在出生前胎兒的血循環(huán)中仍含有較多的造血祖細(xì)胞成分，只出生數(shù)月后才降至成人外周血水平，臍血中的造血祖細(xì)胞的抗原性較弱，移植相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生率較骨髓和外周血少，且癥狀輕，采集保存容易，對供者無任何傷害，因此被認(rèn)為是極具潛力的新的造血祖細(xì)胞來源人CD133高親和肽TR-7是本課題組前期在篩選出鼠高親和肽的基礎(chǔ)上篩選出來的，經(jīng)證實能與人細(xì)胞上的CD133特異結(jié)合。
　　 本研究重點探討
　　 1， CD

8、133+造血祖細(xì)胞對結(jié)直腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，闡明CD133+造血祖細(xì)胞在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能以及大腸癌動員CD133+造血祖細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而進(jìn)入轉(zhuǎn)移灶的原理，為揭示結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移機制及抗轉(zhuǎn)移治療奠定基礎(chǔ)。
　　 2，人CD133高親和肽TR-7，CD133+造血祖細(xì)胞與大腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)，以檢測人CD133高親和肽對CD133+造血祖細(xì)胞的體外的拮抗的生物學(xué)效應(yīng)利用CD133高親和肽與人腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的方式分別

9、對其增殖、粘附及體外運動能力進(jìn)行檢測。
　　 方法
　　 1.CD133+造血祖細(xì)胞的篩選、鑒定及培養(yǎng)
　　 取自南方醫(yī)院產(chǎn)科新生胎兒新鮮臍血標(biāo)本20例，抗凝保存，并均在臍血采集后2小時內(nèi)，采用人淋巴細(xì)胞分離法，分離取出單個核細(xì)胞，再利用CD133+免疫磁珠分離法，分離出CD133+造血祖細(xì)胞，并分別予流式細(xì)胞儀及免疫細(xì)胞染色分析和鑒定樣本量中CD133+細(xì)胞含量，同時在減少誘導(dǎo)CD133+分化的同時，培養(yǎng)CD1

10、33+造血祖細(xì)胞。
　　 2.CD133+造血祖細(xì)胞對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 將CD133+造血祖細(xì)胞與SW480共趨化培養(yǎng)，用MTT法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖及黏附能力的影響，用Transwell小室法檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力的變化。觀察CD133+造血祖細(xì)胞作用前后細(xì)胞增殖、體外侵襲變化
　　 3.CD133高親和肽對CD133+造血祖細(xì)胞作用的拮抗，在上一步的試驗中，加入CD133高親和肽利用平板克隆形

11、成實驗檢測CD133高親和結(jié)合肽對大腸癌細(xì)胞體外增殖能力的影響;應(yīng)用細(xì)胞粘附實驗測定細(xì)胞在纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)上的粘附性、應(yīng)用運動小室實驗、細(xì)胞劃痕實驗檢測該短肽對大腸癌細(xì)胞運動遷移能力的影響。利用One-Way ANOVA檢驗對平板克隆形成實驗、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞運動實驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，應(yīng)用LSD、Dunnett，s T3多重比較來進(jìn)一步比較分析
　　 結(jié)果
　　 1、CD133+造血祖細(xì)

12、胞的篩選、鑒定及培養(yǎng)
　　 由取自南方醫(yī)院產(chǎn)科，臍血標(biāo)本共20份（其中18份成功提取新鮮細(xì)胞，2份失?。?，50～80 ml/份，5％枸櫞酸抗凝，新鮮臍血采集后2h內(nèi)，分離出CD133+造血祖細(xì)胞。從新鮮的臍血中得到的單個核細(xì)胞數(shù)平均為（1.43±0.17）×107/ml，經(jīng)CD133磁珠分離系統(tǒng)分離得CD133+富集細(xì)胞的平均數(shù)為（1.32±0.01）×105/ml，新鮮臍血單個核細(xì)胞中的CD133+細(xì)胞所占比例為（0.8±0.

13、01）％，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD133+CD34+細(xì)胞純度達(dá)到80％以上。CD133+細(xì)胞培養(yǎng)一周后，免疫細(xì)胞化學(xué)染色CD133，顯微鏡下觀察CD133陽性細(xì)胞數(shù)＞90％。
　　 2、CD133+造血祖細(xì)胞對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 CD133+造血祖細(xì)胞能顯著促進(jìn)SW480細(xì)胞的生長(n=60、Z=-6.106、P=0.000)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，即腫瘤細(xì)胞的核深染，異型明顯，細(xì)胞呈多角形或不規(guī)則形，

14、能顯著促進(jìn)SW480細(xì)胞的遷移能力;細(xì)胞黏附實驗表明，含有CD133+造血祖細(xì)胞的實驗組其腫瘤細(xì)胞的黏附能力明顯高于對照組(n=60、Z=-3.679，P=0.000)。利用丙酮沉淀法提取細(xì)胞總蛋白（即濃縮蛋白）檢測MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)實驗組中的3種蛋白表達(dá)水平均高于對照組。
　　 3、不同濃度的TR-7短肽對共培養(yǎng)的各組大腸癌HT-29細(xì)胞增殖能力沒有明顯作用，增殖能力差異沒有統(tǒng)計學(xué)

15、意義（F=1.473，P=0.347）。而且各組腫瘤細(xì)胞的克隆形成率實驗結(jié)果表明四組細(xì)胞增殖能力的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.174，P=0.000)。通過對粘附能力的檢測，不同濃度TR-7對SW480、SW620細(xì)胞粘附能力影響的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（Fht-29=0.428，Pht-29=0.738;Fsw620=3.109，Psw620=0.089）。Transwell細(xì)胞運動實驗顯示不同濃度梯度TR-7共培養(yǎng)后的SW480、SW62

16、0、Lovo細(xì)胞，穿過膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，不同濃度組間具有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。并且TR-7濃度越大穿膜的細(xì)胞數(shù)越少，對細(xì)胞運動能力的影響越明顯。細(xì)胞劃痕實驗進(jìn)一步證實隨著TR-7短肽濃度的增加，lovo細(xì)胞劃痕部位遷移的細(xì)胞數(shù)越少。
　　 結(jié)論
　　 1、CD133+造血祖細(xì)胞可顯著促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，CD133+造血祖細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞裸鼠共移植具有促轉(zhuǎn)移作用，初步證明，人造血祖細(xì)胞可能對人