腫瘤標志物中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)與鈣調(diào)磷酸酶B同源蛋白2(CHP2)的生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景:乳腺癌是威脅女性生存的主要腫瘤之一。NGAL為lipocalin蛋白家族的新成員,具有典型的β折疊桶狀保守結(jié)構(gòu),是一種25kD的分泌型糖蛋白。因其結(jié)合配體的多樣性,NGL在諸如細胞生長、分化、腫瘤遷移與侵襲以及EMT轉(zhuǎn)變等眾多生理與病理學(xué)過程中扮演著重要的角色。大量研究結(jié)果表明NGAL是一種新的腫瘤標志物,為潛在的腫瘤治療靶點。NGAL的生物學(xué)功能及其表達調(diào)控模式因腫瘤種類及其分型而有所不同。研究表明在乳腺癌中NGAL的表達亦與乳

2、腺癌種類及亞型有關(guān),其表達受雌激素受體ER以及轉(zhuǎn)錄因子NFAT的調(diào)控。在機體內(nèi)部基因表達調(diào)控是一個十分復(fù)雜的過程,NGAL在腫瘤細胞內(nèi)表達的異質(zhì)性正顯示了基因表達調(diào)控的復(fù)雜性。C/EBPζ為C/EBP家族轉(zhuǎn)錄因子成員,對C/EBP家族其他成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性起著負調(diào)控的作用。已有研究表明在白血病等腫瘤中C/EBPζ表達明顯降低。結(jié)合文獻以及生物信息學(xué)分析我們在NGAL的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了潛在的C/EBPζ作用位點,但C/EBPζ是否參與NGA

3、L的表達調(diào)控尚不明確。鈉氫交換體1(NHE1,Na+/H+exchanger1)對細胞的pHi起著重要的調(diào)節(jié)作用,腫瘤細胞內(nèi)的堿化作用是腫瘤進程中的標志性事件之一。NHE1介導(dǎo)的腫瘤細胞內(nèi)pHi升高是否對乳腺癌細胞內(nèi)C/EBPζ以及NGAL的表達具有調(diào)控作用仍不明了。
　　 目的:以ER受體陰性、具高侵襲能力的乳腺癌MDA-MB-231細胞株為研究對象,分析轉(zhuǎn)錄因子C/EBPζ以及NGAL基因在其轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用及其機制。在此

4、基礎(chǔ)上闡明NHE1以及C/EBPζ對NGAL基因的調(diào)控機制。
　　 方法:采用實時定量PCR、western blotting技術(shù)檢測NGAL在遷移能力不同的細胞系中的差異性表達；通過過表達轉(zhuǎn)錄因子C/EBPζ以及基因沉默技術(shù)干擾NGAL基因分別研究C/EBPζ以及NGAL在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用。酶譜法檢測過表達C/EBPζ以及干擾NGAL后MMPs蛋白活性的改變。構(gòu)建NGAL啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒,采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)

5、研究C/EBPζ以及NHE1對NGAL轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。采用WNT以及NF-κB通路的抑制劑分析了相關(guān)信號通路在NGAL介導(dǎo)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用。
　　 結(jié)果:相比低遷移能力的ER+的乳腺癌細胞系MCF7,MDA—MB-231細胞系中NGAL基因的表達顯著升高,顯示了NGAL對轉(zhuǎn)移能力的潛在調(diào)控。過表達C/EBPζ以及干擾NGAL基因后MDA-MB-231細胞的轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制,細胞的MMPs家族蛋白的表達及其活性均受到影

6、響。雙熒光素酶報告實驗證實C/EBPζ對NGAL基因啟動子的活性有明顯的調(diào)節(jié)作用。采用NHE1的選擇性抑制劑Cariporide抑制其活性后,MDA-MB-231細胞的侵襲能力受到明顯抑制。雙熒光素酶報告實驗證實這種抑制作用部分源于C/EBPζ升高所引起NGAL表達降低來完成的。
　　 結(jié)論:C/EBPζ通過調(diào)節(jié)NGAL啟動子的轉(zhuǎn)錄活性來抑制NGAL的表達,進而實現(xiàn)其對MDA—MB-231細胞轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控。NHE1以及基質(zhì)金屬