四氫嘧啶類化合物Zl-5015的抗炎作用及其作用機制研究.pdf

1、目的：
　　 研究四氫嘧啶類化合物ZL-5015（1，3-二環(huán)戊基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯）的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其作用機制。
　　 方法：
　　 1.以丁炔二甲酸二乙酯、甲醛、環(huán)戊胺為原料，冰醋酸為催化劑，在乙醇溶劑中經(jīng)氨基化作用、Mannich反應(yīng)、親核加成反應(yīng)和脫氫環(huán)化反應(yīng)等一步法合成四氫嘧啶類化合物ZL-5015。經(jīng)柱層析分離純化。
　　 2.采用二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳郭腫脹模型，觀察

2、ZL-5015體內(nèi)給藥的抗炎作用。取BALB/c小鼠50只，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg.b.w)。各組均用0.5％ CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后1h，在每只小鼠右耳上均勻涂布二甲苯20μl致炎，40min后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳郭線剪下左、右耳片，用內(nèi)徑為7mm的打孔器分別在左、

3、右耳相同位置打下耳片，稱重，計算耳郭腫脹度。
　　 3.采用角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足趾腫脹模型，觀察ZL-5015對大鼠體內(nèi)給藥的抗炎作用。取SD大鼠40只，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg.b.w)。各組均用0.5％ CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后1h，從大鼠右后足趾向遠心端方向皮下注

4、射高壓滅菌的1％角叉菜膠生理鹽水液0.1ml/只大鼠，并用記號筆在踝關(guān)節(jié)處做好標記，用大鼠足趾容積測量儀分別在注射1％角叉菜膠生理鹽水液前(0h)，及后1、2、3、4、5h時刻測定大鼠右后足容積。計算大鼠足趾腫脹度。
　　 4.采用醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體模型，觀察ZL-5015體內(nèi)給藥的抗炎鎮(zhèn)痛作用。取BALB/c小鼠50只，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(100mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中

5、、低劑量組(100、50、25mg/kg.b.w)。各組均用0.5％ CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h，按0.1ml/10g.b.w腹腔注射新配制的0.7％醋酸生理鹽水液。觀察并記錄注射0.7％醋酸生理鹽水液后20min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。
　　 5.采用熱板致痛模型，觀察ZL-5015體內(nèi)給藥對小鼠的鎮(zhèn)痛作用。取BALB/c小鼠若干只（大于50只），體重（20±2）g，雌性，實驗前經(jīng)50℃熱板篩

6、選剔除痛閾值大于30s或小于10s的動物，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，曲馬多陽性藥物組(10mg/kg.b.w)及化合物ZL-5015高、中、低劑量組(100、50、25mg/kg.b.w)。各組均用0.5％ CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天，末次給藥后1h測定痛閾，以小鼠足部接觸熱板到開始舔后足的時間為痛閾值。觀察并記錄痛閾。
　　 6.采用MTT法檢測ZL-5015對小鼠巨噬細胞和RAW264.7巨

7、噬細胞代謝活力的影響。
　　 7.采用LPS(10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細胞以及RAW264.7巨噬細胞活化作為體外炎癥模型，觀察ZL-5015體外對腹腔巨噬細胞和RAW264.7巨噬細胞分泌炎癥相關(guān)因子的影響。采用Griess試劑盒檢測一氧化氮(NO)的含量;ELISIA法檢測白細胞介素-1(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、前列腺素E2(PGE2)的

8、含量。
　　 8.采用LPS(10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細胞以及RAW264.7巨噬細胞活化作為體外炎癥模型，觀察ZL-5015體外對腹腔巨噬細胞和RAW264.7巨噬細胞表達COX-2、iNOS mRNA的影響。實時熒光定量PCR法檢測目的基因mRNA的相對含量（2-ΔCt，以GAPDH為內(nèi)參）。
　　 結(jié)果：
　　 一步法合成的四氫嘧啶類化合物ZL-5015（1，3-二環(huán)戊基-1，2，3，6-四氫嘧啶-

9、4，5-二甲酸二乙酯）經(jīng)硅膠柱層析分離純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、1H-NMR和13C-NMR得到確證。
　　 化合物ZL-5015高、中劑量組(100、50mg/kg.b.w)均能明顯抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳郭腫脹，平均耳郭腫脹抑制率分別為49.2％、41.8％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011、P=0.031)。
　　 測量時間為3h時，化合物ZL-5015在高、中、低劑量時(100、50、25mg/kg.b.w)

10、對大鼠足趾腫脹均有明顯抑制，平均抑制率分別為53.2％、41.3％、28.7％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P=O.000、P=0.003、P=0.031）。
　　 化合物ZL-5015高、中、低劑量(100、50、25mg/kg.b.w)均能顯著減少正常小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，平均扭體反應(yīng)抑制率分別為51.8％、39.6％、32.7％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000、P=0.001、P=0.005)。
　　

11、化合物ZL-5015高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg.b.w）可延長熱板致小鼠疼痛的閾值，痛閾提高百分率分別為23.4％、13.0％、5.5％，但只有高劑量組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。
　　 在LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞6h后，培養(yǎng)上清中促炎細胞因子TNF-α及炎癥介質(zhì)PGE2的含量或LPS刺激24h后，促炎細胞因子IL-1β和炎癥相關(guān)因子NO的含量大幅增加?；衔颶L-5015（40μM、20

12、μM）組能部分抑制由LPS誘導(dǎo)的上述促炎細胞因子及炎癥因子或介質(zhì)的分泌，其對IL-1β、TNF-α、PGE2、NO的抑制率分別是:41.1％、29.1％(IL-1β);42.9％、33.8％(TNF-α);57％、45.1％(PGE2);67.1％、49.4％(NO)，各指標均數(shù)與LPS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（IL-1β:P=0.000、P=0.000;TNF-α: P=0.005、P=0.019; PGE2:P=0.001、P=0.

13、005; NO:P=0.000、P=0.000）。化合物ZL-5015在80μM以上時對小鼠巨噬細胞的活力有明顯抑制作用，抑制率為25.2％;濃度在40μM以下時，無明顯抑制作用。80μM的ZL-5015能抑制小鼠巨噬細胞分泌IL-10，抑制率為66.3％;當(dāng)其濃度在40μM以下時，能夠輕度促進小鼠巨噬細胞IL-10的分泌，提高率分別為7.1％、6.1％。
　　 在LPS刺激RAW264.7巨噬細胞6h后，培養(yǎng)上清中促炎細胞因子

14、TNF-α及炎癥介質(zhì)PGE2的含量或LPS刺激24h后，促炎細胞因子IL-1β和炎癥相關(guān)因子NO的含量大幅增加。化合物ZL-5015(40μM、20μM)組能部分抑制由LPS誘導(dǎo)的上述促炎細胞因子及炎癥因子或介質(zhì)的分泌，其抑制率分別為:60.9％、36.2％(NO);43.4％、28％(IL-1β);34.8％、26.3％(TNF-α);66.5％、51.6％(PGE2)各指標均數(shù)與LPS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(IL-1β:P=0.0

15、00、P=0.017;TNF-α:P=0.004、P=0.025;PGE2:P=0.000、P=0.002;NO: P=0.000、P=0.000)。80μM的ZL-5015對RAW264.7巨噬細胞的活力有明顯的抑制作用，抑制率29.7％，且能抑制RAW264.7細胞分泌IL-10，抑制率為62.9％;當(dāng)其濃度在80μM以下時，對RAW264.7細胞的活力無明顯影響，但能輕度促進RAW264.7細胞分泌IL-10，提高率分別為4.0％

16、、12.0％、7.0％。
　　 經(jīng)過LPS體外刺激24h后，小鼠腹腔巨噬細胞COX-2、iNOS mRNA的表達明顯增多，化合物ZL-5015（40μM、20μM）組可部分抑制由LPS誘導(dǎo)的上述目的基因mRNA的表達，抑制率分別為37.9％、29.1％(COX-2);41.5％、36.5％(iNOS)，各指標均數(shù)與LPS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(COX-2:P=0.001、P=0.008;iNOS:P=0.000、P=0.01)

17、;經(jīng)過同樣處理的RAW264.7巨噬細胞，化合物ZL-5015(40μM、20μM)組可部分抑制由LPS誘導(dǎo)的上述目的基因mRNA的表達，抑制率分別39.5％、31.6％(COX-2);38.5％、31.6％(iNOS)，各指標均數(shù)與LPS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(COX-2:P=0.001、P=0.007;iNOS:P=0.001、P=0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.四氫嘧啶類化合物ZL-5015（1，3-二環(huán)

18、戊基-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯）可以通過以丁炔二甲酸二乙酯、甲醛、環(huán)戊胺為原料，經(jīng)氨基化作用、Mannich反應(yīng)、親核加成反應(yīng)和脫氨基環(huán)化等多組分反應(yīng)合成。該制備方法具有反應(yīng)步驟簡單，原料易得，反應(yīng)條件溫和，目標產(chǎn)物收率高等優(yōu)點。反應(yīng)粗產(chǎn)物可經(jīng)硅膠柱層析，以正己烷∶乙酸乙酯(V∶V=1∶7～1∶4)為流動相分離純化，操作簡單、易行。
　　 2.化合物ZL-5015對二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳郭腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)的大

19、鼠足趾腫脹度均有抑制作用，提示其具有抗炎作用。
　　 3.化合物ZL-5015可以顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)并有一定的劑量依賴關(guān)系，提示其具有鎮(zhèn)痛或抗炎活性。
　　 4.化合物ZL-5015在高劑量(100mg/kg.b.w)時可以延長熱板法的痛閾值，提示其具有弱的中樞鎮(zhèn)痛活性。
　　 5.化合物ZL-5015體外可部分抑制內(nèi)毒素刺激巨噬細胞（小鼠腹腔巨噬細胞，RAW264.7巨噬細胞）IL-1β、IL-6、T

20、NF-α促炎因子的分泌，提示其抗炎作用與抑制這些促炎癥細胞因子的分泌有關(guān)。
　　 6.化合物ZL-5015體外可提高內(nèi)毒素刺激巨噬細胞（小鼠腹腔巨噬細胞，RAW264.7巨噬細胞）培養(yǎng)上清中IL-10的含量，提示ZL-5015可通過提高IL-10的產(chǎn)生或分泌來抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。
　　 7.化合物ZL-5015可以顯著抑制巨噬細胞（小鼠腹腔巨噬細胞，RAW264.7巨噬細胞）NO和PGE2的分泌，且

21、呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，提示其抗炎作用與抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生或分泌有關(guān)。
　　 8.化合物ZL-5015體外可部分抑制內(nèi)毒素刺激巨噬細胞（小鼠腹腔巨噬細胞，RAW264.7巨噬細胞）COX-2和iNOS mRNA的表達，提示可通過抑制相關(guān)合成酶mRNA的表達減少NO、PGE2的產(chǎn)生，但對其mRNA表達的抑制率低于對NO、PGE2產(chǎn)生的抑制率，提示ZL-5015對iNOS、COX-2的酶活性亦有抑制作用或存在其他的作用機制，有待進一步