四氫嘧啶類化合物LH-2703抗炎免疫藥理作用的研究.pdf

1、目的:
　　 以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，合成四氫嘧啶類化合物LH-2703，探討其抗炎鎮(zhèn)痛及免疫藥理作用。
　　 方法:
　　 1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，合成四氫嘧啶類化合物LH-2703（1，3-二苯基-1,2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯），經(jīng)柱層析分離純化;
　　 2、取昆明種小鼠50只，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(200mg/kg.b.w

2、)及化合物LH-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。采用二甲苯誘導小鼠耳廓腫脹模型每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后1h，在每只小鼠右耳上均勻涂布二甲苯40μl（耳廓內(nèi)外兩側各20μl）致炎，30min后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓線剪下左、右耳片，用內(nèi)徑為8mm的打孔器分別在左、右耳相同位置打下耳片，稱重，計算耳廓腫脹度;
　　 3、取SD大鼠40只，

3、隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(200mg/kg.b.w)及化合物LH-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。每日灌胃1次，連續(xù)給藥3天。末次給藥后60min，從大鼠右后足趾向遠心端方向皮下注射高壓滅菌的1％角叉菜膠生理鹽水液0.1ml/只大鼠，并用記號筆在踝關節(jié)處做好標記，用大鼠足趾容積測量儀分別在注射1％角叉菜膠生理鹽水液，1、2、3、4及

4、5h時刻測定大鼠右后足容積。計算大鼠足趾腫脹度;
　　 4、取昆明種小鼠60只，隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，阿司匹林陽性藥物組(200mg/kg.b.w)及化合物LH-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。灌胃給藥，單次給藥后60min，按0.1ml/10g.b.w腹腔注射新配制的0.7％醋酸生理鹽水液。觀察并記錄注射0.7％醋酸生理鹽水液后20min

5、內(nèi)小鼠扭體次數(shù);
　　 5、取健康昆明種小鼠50只，實驗前將鼠尾進入（50±0.5）℃恒溫水浴鍋，記錄甩尾反應潛伏期為痛閾。預選痛閾5-30s者為合格鼠。隨機均分為5組，分別為溶媒對照組，鹽酸曲馬多陽性藥物組(10mg/kg.b.w)及化合物LH-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。單次灌胃給藥，于給藥后0.5h時測定小鼠痛閾值;
　　 6、取昆明

6、種小鼠50只，體重（20±2）g，雌性，實驗前經(jīng)55℃熱板篩選剔除痛閾值大于30s或小于5s的動物，隨均分為5組，分別為溶媒對照組，曲馬多陽性藥物組(10mg/kg.b.w)及化合物LH-2703高、中、低劑量組(200、100、50mg/kg.b.w)。各組均用0.5％CMC-Na的水溶液配制。灌胃給藥1次。于給藥后0.5h測定痛閾，以小鼠足部接觸熱板到開始舔后足的時間為痛閾值。觀察并記錄痛閾;
　　 7、采用Griess試劑

7、盒觀察其對正常小鼠巨噬細胞分泌一氧化氮(NO)的影響;ELISIA法檢測白細胞介素-1(IL-1β)含量;
　　 8、MTT法檢測正常小鼠脾細胞的代謝活力;
　　 9、采用小鼠碳粒廓清、溶血素及遲發(fā)型變態(tài)反應模型分別觀察其對正常小鼠非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫的影響。
　　 結果:
　　 合成了四氫嘧啶類化合物LH-2703（1，3-二苯基-1,2，3，6-四氫嘧啶-4，5-二甲酸二乙酯），經(jīng)硅膠柱層

8、析分離純化，其結構經(jīng)MS、1H-NMR和13C-NMR確證?；衔風H-2703在高、中、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)均能顯著抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹，平均耳廓腫脹抑制率分別為53.1％、46.3％、26.6％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P＜0.001，P=0.013);測量時間為3h時，化合物LH-2703在高、中劑量時(200、100mg/kg.b.w)對大鼠足趾腫脹均有顯著抑制，平均抑制

9、率分別為46.4％、33.9％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P=0.007);化合物LH-2703高、中、低劑量(200、100、50mg/kg.b.w)均能顯著減少正常小鼠扭體反應次數(shù)，平均扭體反應抑制率分別為51.3％、40.8％、25.1％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P=0.002，P=0.047);化合物LH-2703高劑量組(200mg/kg.b.w)對小鼠熱水浴甩尾反應潛伏期能顯著延長，

10、痛閾提高百分率為36.4％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學意義(P=0.044);LH-2703高、中劑量組(200、100mg/kg.b.w)對小鼠熱板法的痛閾時間顯著延長，痛閾提高百分率分別為48.0％、23.7％，與溶媒對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，P=0.006);化合物LH-2703高濃度組(20μg/ml)對腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO和IL-1β都有不同程度的抑制作用，抑制率分別為26.8％、29.9％，與LPS對照組比較有統(tǒng)

11、計學意義(P=0.036，P=0.009);化合物LH-2703對正常小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫，均沒有顯著作用。
　　 結論:
　　 1、以丁炔二酸二乙酯、甲醛、苯胺為原料，經(jīng)氨基化作用、Mannich反應、親核加成反應和脫氨基環(huán)化等多組分反應合成了四氫嘧啶類化合物LH-2703，方法具有操作簡單，原料易得，反應條件溫和，反應收率高等優(yōu)點。
　　 2、反應粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚:乙酸乙酯(V∶

12、V=1:7～1:5)為流動相分離純化，方法操作簡單、易行。
　　 3、化合物LH-2703對二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導的大鼠足趾腫脹度均有良好的抑制作用，提示其具有良好的抗炎作用。
　　 4、化合物LH-2703可以顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數(shù)和延長扭體潛伏期，并有一定的劑量依賴關系，提示其具有良好的外周鎮(zhèn)痛活性。
　　 5、化合物LH-2703在200mg/kg.b.w劑量時可以顯著延長熱水浴甩尾及

13、熱板法的痛閾值，提示其具有良好的中樞鎮(zhèn)痛活性。
　　 6、化合物LH-2703可以顯著抑制巨噬細胞NO和IL-1β的分泌，且有一定的劑量依賴性，提示其具有良好的抑制炎癥因子的作用。
　　 7、化合物LH-2703對正常小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細胞免疫，均沒有顯著作用，提示其對體內(nèi)免疫系統(tǒng)無顯著影響。
　　 8、化合物LH-2703對小鼠正常脾細胞代謝活力有一定的抑制作用，提示其對體外免疫細胞有一定調(diào)節(jié)作用。