TOLL樣受體4-核轉(zhuǎn)錄因子--κB信號(hào)通路在脂多糖誘導(dǎo)奶牛乳腺炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、奶牛乳房炎通常就是指乳腺發(fā)生了炎癥，是由多種因素引起嚴(yán)重程度不同的復(fù)雜疾病。最后會(huì)由于環(huán)境、病原體以及宿主的不同而導(dǎo)致不同的后果，因此治療代價(jià)較高且不容易治愈。當(dāng)致病菌進(jìn)入到無(wú)菌環(huán)境，常常會(huì)破壞一些物理屏障如乳頭而引起乳房炎，這就需要及時(shí)和適當(dāng)?shù)乃拗鞣烙鶃?lái)防止細(xì)菌的滋生避免炎癥的加劇。另一方面，這些傳染性病原體如金黃色葡萄球菌和鏈球菌很容易從感染牛的一個(gè)乳區(qū)蔓延到其它乳區(qū)或者是其它的牛。像年齡、泌乳階段和體細(xì)胞評(píng)分這些因素都會(huì)影響牛感染

2、乳房炎的幾率。不同的病原體會(huì)引起不同的乳房炎從而導(dǎo)致乳腺組織產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)，因此宿主需要根據(jù)病原體的情況來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答從而保護(hù)機(jī)體免受感染。
　　本試驗(yàn)以中國(guó)荷斯坦奶牛的乳腺組織和乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，研究了炎癥信號(hào)通路的作用機(jī)制。通過(guò)組織學(xué)觀察正常和乳房炎乳腺組織的結(jié)構(gòu)差異，采用基因芯片的方法分析了TLR4/ NF-κB炎癥信號(hào)通路在正常與乳房炎乳腺組織中的基因表達(dá)情況;利用體外培養(yǎng)的方法，研究了化學(xué)抑制和siRNA抑制

3、NF-κB基因?qū)θ橄偕掀ぜ?xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響;運(yùn)用蛋白質(zhì)組iTRAQ技術(shù)，篩選激活和抑制p65條件下乳腺上皮細(xì)胞中的差異蛋白。
　　1.荷斯坦奶牛正常與乳房炎乳腺組織的基因表達(dá)譜芯片分析
　　宿主感染乳房炎后會(huì)引起Toll樣受體4介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)了炎癥相關(guān)基因的表達(dá)和先天免疫反應(yīng)。在本試驗(yàn)中，運(yùn)用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析了正常與感染乳房炎乳腺組織中的全部基因表達(dá)

4、水平的情況。在這些基因中對(duì)參與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，共產(chǎn)生48個(gè)差異表達(dá)的基因，與正常組織相比較，其中有19個(gè)基因在感染乳房炎乳腺組織中表達(dá)上調(diào)，有29個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。同時(shí)挑選了主要的10個(gè)基因CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB、IL-12、TLR4、MyD88、IL-6和IL-10進(jìn)行了熒光定量PCR驗(yàn)證，挑選了4個(gè)基因進(jìn)行Western-blot驗(yàn)證，結(jié)果顯示與正常乳腺組織相比較TLR4

5、、MyD88、IL-6和IL-10在患乳房炎乳腺組織中表達(dá)上調(diào)，CD14、TNF-α、MD-2、IL-1β、NF-κB和IL-12表達(dá)下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。對(duì)這些差異表達(dá)的基因，利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資源如GO和KEGG進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因調(diào)控著與免疫功能相關(guān)的不同通路。
　　2.化學(xué)干涉抑制NF-κB基因?qū)LR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響
　　研究表明，脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分，在炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)中起著關(guān)

6、鍵的作用。LPS信號(hào)主要通過(guò)TLR4激活NF-κB從而誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。本試驗(yàn)利用乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法，研究NF-κB基因的特異性化學(xué)抑制劑bay11-7082對(duì)乳腺細(xì)胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)采用常用的組織塊接種法，得到純度較高的乳腺上皮細(xì)胞，隨后進(jìn)行LPS處理細(xì)胞建立炎癥模型和NF-κB基因抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明LPS能夠激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路。通路上的一些基因如TLR4、NF-κB、My

7、D88、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平表達(dá)增加以及TLR4、NF-κB、IL-1β和TNF-α的蛋白含量增加。Bay11-7082處理細(xì)胞后，NF-κB的表達(dá)顯著下降，對(duì)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞IL-1β和TNF-α的釋放減少，炎癥信號(hào)通路上的基因如TLR4、MyD88和IL-6的表達(dá)都有一定程度的降低。
　　3.基因干涉NF-κB基因表達(dá)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞炎癥通路相關(guān)基因的影響
　　為了使試驗(yàn)設(shè)計(jì)更加嚴(yán)謹(jǐn)，試驗(yàn)

8、結(jié)果具有可重復(fù)性，除了化學(xué)抑制NF-κB基因還通過(guò)基因干涉來(lái)沉默NF-κB基因，從而觀察對(duì)乳腺上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因的影響。在得到純度較高的牛乳腺上皮細(xì)胞后，進(jìn)行NF-κB基因干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明，NF-κB-siRNA處理細(xì)胞后抑制了NF-κB基因從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的移位。同時(shí)促炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)明顯下降。TLR4/NF-κB信號(hào)通路上的一些主要基因如TLR4、NF-κB、MyD88和IL-6的表達(dá)

9、明顯下降而CD14、IL10和MD-2的表達(dá)卻顯著增加。結(jié)果與化學(xué)抑制試驗(yàn)相一致。
　　4.激活和抑制p65條件下乳腺上皮細(xì)胞差異蛋白質(zhì)的篩選
　　除了在基因水平觀察NF-κB基因?qū)ρ装Y通路的影響，更從蛋白的水平來(lái)篩選激活和抑制前后的差異蛋白質(zhì)。在本試驗(yàn)中，分別將乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行3組處理:不作任何處理的乳腺上皮細(xì)胞;用LPS處理的乳腺上皮細(xì)胞;用 LPS乖bay11-7082處理的乳腺上皮細(xì)胞，運(yùn)用相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)和液相色

10、譜法識(shí)別不同的調(diào)節(jié)蛋白。將LPS組與不作處理組相比較獲得差異表達(dá)的蛋白，將加入LPS和bay11-7082組與LPS組進(jìn)行比較獲得相應(yīng)的差異蛋白。共篩選出17個(gè)蛋白，其中有8個(gè)蛋白在LPS組表達(dá)顯著下調(diào)，在bay11-7082組表達(dá)卻顯著上調(diào)，有9個(gè)蛋白在LPS組表達(dá)顯著上調(diào)，在bay11-7082組表達(dá)顯著下調(diào)。P65蛋白與LPS vs空白組中差異蛋白質(zhì)的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，途中共有225個(gè)點(diǎn)，形成兩兩相互作用關(guān)系有717個(gè)，p65蛋白與

11、bay11-7082vs LPS中差異蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有56個(gè)點(diǎn)，形成的兩兩互作關(guān)系有77個(gè)。
　　綜上所述，得出以下結(jié)論:
　　1.在正常與乳房炎乳腺組織中篩選出了參與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的48個(gè)差異表達(dá)的基因，這些基因還分別參與了TOLL樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程，結(jié)果表明乳腺組織在細(xì)菌的感染后會(huì)通過(guò)TLR4/NF-κB通路釋放細(xì)胞因子和趨化因子。
　　2.在LPS

12、誘導(dǎo)的炎癥模型中，激活了TLR4/NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)了炎癥因子的表達(dá)，致細(xì)胞損傷，通過(guò)化學(xué)抑制和siRNA干擾兩種抑制方法沉默NF-κB，均下調(diào)了炎癥因子的表達(dá)，并影響炎癥信號(hào)通路上相關(guān)基因的表達(dá)。
　　3.在抑制和激活條件下，蛋白芯片共篩選出17個(gè)差異表達(dá)蛋白，在P65蛋白與LPS vs空白組中差異蛋白質(zhì)的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中，篩選出了與p65蛋白連接度和壓力向心性較高的13個(gè)基因;在p65蛋白與bay11-7082 vs L