硒抗肽聚糖誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥損傷作用及其TLR2-NOD2信號通路的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛產后重要疾病之一，會造成巨大的經濟損失。乳腺炎不局限于細菌感染，其特征在于白細胞和血清蛋白從血液轉移到感染部位的運動。硒是哺乳動物飲食中的必需營養(yǎng)物質，具有一些抗炎性質。硒以硒蛋白的形式存在于機體中，并主要通過其抗氧化作用參與到機體的免疫防御機制中。多項研究已證實，飼喂添加適量的硒的飼料，可以最大限度地降低動物群體中乳腺炎，白肌病以及呼吸系統(tǒng)方面的疾病的發(fā)病率。肽聚糖(PGN)是金黃色葡萄球菌細胞壁結構上的主要成分，有研

2、究表明金葡菌的肽聚糖可以刺激宿主細胞上相關病原識別受體，激活炎癥信號通路。因此，本論文從分子學的角度研究了硒的抗炎作用以及硒對相關炎癥信號通路的影響，為乳腺炎未來的防控發(fā)展提供了理論依據。
　　金黃色葡萄球菌是臨床上奶牛乳腺炎最重要的致病菌之一，通過研究其一種致病因子來探索其致病機理以及機體對其反應機制，這對奶牛乳腺炎的防治具有重要的現(xiàn)實意義。我們通過膠原酶完全消化法體外培養(yǎng)了一批奶牛乳腺上皮原代細胞，用PGN侵染細胞構建了奶牛乳

3、腺上皮細胞(bMEC)炎癥模型，檢測在PGN刺激下其細胞因子表達的變化。實驗結果表明，乳腺上皮細胞在匯合之前呈典型的島嶼狀集落生長，匯合之后的細胞形態(tài)具有典型的鋪路石樣、導管樣結構的特點，一直培養(yǎng)下去會形成穹窿樣結構。
　　為了探索硒濃度對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響，我們選擇不同濃度(0、1、2、4、8、16、32和64μM)的硒處理奶牛乳腺上皮細胞12h后，利用MTT法對活細胞特有的反應檢測細胞存活率。結果表明，在0～16μM范

4、圍內的硒濃度對細胞活性影響不大，16μM以上隨著硒濃度的增加，乳腺上皮細胞的存活率逐漸下降，且在32μM和64μM的硒濃度時細胞活性與對照組相比出現(xiàn)極顯著下降(p＜0.001)，這說明高濃度的硒對乳腺上皮細胞具有損傷作用。
　　為研究硒在PGN誘導的BMECs的炎癥反應中對TLR2和Nod2信號通路的影響。不同濃度的硒(2、4和8μM)添加在培養(yǎng)液中，檢測硒對TLR2、Nod2/NF-κB、MAPK信號通路的影響。實驗結果表明，P

5、GN刺激后8h，10h，12h時，2、4和8μM的硒均能有效地抑制PGN誘導的bMECs TLR2通路上，TLR2，Myd88; Nod2通路上Rip2以及兩條通路的下游NF-κB，TNF-α，IL-1β，IL-6促炎因子的基因表達(p＜0.01或p＜0.001)。其中8h時，2和8μM的硒對Nod2沒有明顯的抑制作用。
　　我們采用We sternBlot技術從蛋白水平研究硒對炎癥信號通路的影響，尤其是對TLR2、Nod2/NF

6、-κB、MAPK信號通路中關鍵蛋白的表達進行檢測。將bMECs分成5組，以不添加亞硒酸鈉和PGN的細胞作為空白對照組，以加PGN刺激0.5 h的細胞作為模型組，以添加不同濃度的亞硒酸鈉（2、4和8μM）預孵12h并用PGN刺激0.5 h的細胞作為加硒劑量組，分別檢測TLR2，Myd88; Nod2、Rip2、Card9;IκBα、p65; p38、JNK和Erk蛋白的磷酸化水平。結果顯示，PGN刺激乳腺上皮細胞0.5 h后TLR2、My

7、d88、Nod2、Rip2、Card9、IκBα、p65、p38、JNK和Erk蛋白的磷酸化水平與空白對照組相比極顯著上升(p＜0.001)。與模型組相比，4μM的硒能極顯著抑制PGN誘導的TLR2通路TLR2、Myd88的磷酸化;Nod2通路Rip2的磷酸化;NF-κB通路IBα、p65的磷酸化(p＜0.001)，同時極顯著降低了PGN誘導的MAPK通路p38、JNK和Erk的磷酸化(p＜0.001)。這些結果表明4μM的硒通過調節(jié)T