下調(diào)P2X-,4-表達(dá)對(duì)永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響.pdf

1、目的：神經(jīng)損傷后神經(jīng)末梢和受損的細(xì)胞釋放大量的ATP，ATP激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞膜上P2X4受體，促使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)，如IL-1，IL-6，TNF等，是神經(jīng)病理性痛發(fā)生的主要機(jī)制之一。P2X4受體作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，日益受到研究關(guān)注。目前研究已證實(shí)向正常大鼠鞘內(nèi)注入P2X4受體已被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可引發(fā)異常疼痛，而注入P2X4受體基因的反義寡核苷酸片段能減輕此種疼痛。本實(shí)驗(yàn)篩選永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞特異性P2X4s

2、iRNA，并將其轉(zhuǎn)染至永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，鑒定其表達(dá)，并探討下調(diào)P2X4對(duì)永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。
　　 方法：
　　 1.特異性P2X4siRNA的篩選及鑒定轉(zhuǎn)染FAM-siRNA 16 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率；設(shè)計(jì)3條特異性siRNA經(jīng)lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，72 h后半定量RT-PCR觀察干擾前后P2X4基因mRN

3、A水平表達(dá)，比較對(duì)應(yīng)不同位點(diǎn)的三對(duì)siRNA片段對(duì)P2X4基因的干擾效果，分析RNA干擾的特異性，從中篩選出特異性最高的一條siRNA；轉(zhuǎn)染該序列72 h后Western blot檢測(cè)P2X4的表達(dá)。
　　 2.下調(diào)P2X4基因表達(dá)對(duì)永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響體外培養(yǎng)永生化小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染siRNA-F1組。空白對(duì)照組未進(jìn)行任何干預(yù)，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染N control siRNA，轉(zhuǎn)

4、染siRNA-F1組轉(zhuǎn)染先前篩選出來(lái)的1條特異性siRNA。72 h后，用50 μM ATP刺激，采用LSCM檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]I)，P2X4R/OX42免疫熒光雙標(biāo)染色觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.激光掃描共聚焦顯微鏡顯示轉(zhuǎn)染效率達(dá)80[％]；三對(duì)siRNA片段中siRNA-F1的沉默效率最高，最大干擾效率達(dá)72.2％；We

5、stern blot顯示轉(zhuǎn)染siRNA-F1后P2X4蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 2.轉(zhuǎn)染siRNA-F1組ATP活化小膠質(zhì)細(xì)胞后，胞內(nèi)鈣離子釋放較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組減少；P2X4R/OX42免疫熒光雙標(biāo)染色顯示轉(zhuǎn)染siRNA-F1組細(xì)胞存在活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞和靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組只存在活化態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 成功篩選出一條特異性 P2X4siRNA—siRNA-F1，能夠下調(diào)永