eRF3b羧基端部分多肽片段的分子克隆、表達(dá)及抗體制備.pdf

1、目的：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種在世界范圍內(nèi)廣為流行的一種疾病，是已知各型肝炎中危害最嚴(yán)重的一種。我國(guó)是世界肝炎大國(guó)，大約有7億人感染過(guò)乙肝，即總感染率為57％;有2300萬(wàn)慢性肝炎患者，9300萬(wàn)乙肝病毒攜帶者；每年因肝炎死亡的人數(shù)約有23萬(wàn)人[1]。鑒于上述原因，我國(guó)在乙肝的預(yù)防和治療上也花費(fèi)了很多費(fèi)用，有報(bào)導(dǎo)可見每年防治乙肝的經(jīng)費(fèi)約500億人民幣[2，3]。盡管對(duì)于乙肝的研究很多，但是乙肝迄今為止也沒(méi)有很好

2、的治愈方法，所以乙肝對(duì)全國(guó)人民的健康水平和國(guó)家財(cái)政收入都造成了很大的威脅。因此，臨床上迫切需要研究新的靈敏度和特異度都較高的診斷方法，并且發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的生物標(biāo)志物，爭(zhēng)取做到早預(yù)防、早診斷、早治療，改善病人情況。
　　 研究乙型病毒性肝炎機(jī)制及其制備eRF3b羧基端部分多肽片段多克隆抗體，具有重大意義。本室前期利用MALDI-TOFMS技術(shù)發(fā)現(xiàn)4210Da蛋白為“GSPT2，真核肽鏈釋放因子GTP結(jié)合亞單位(eRF)”，也就是e

3、RF3b裂解后的一部分-37肽。GSPT2編碼eRF3b，具有參與蛋白合成中止的功能。eRF3b在肝臟感染乙肝病毒后的免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，4210Da多肽作為其中一部分肽段而不斷出現(xiàn)在血液中，而且表達(dá)量在不同肝病組中差異明顯，提示該蛋白可以作為急性乙肝（AHB）轉(zhuǎn)為慢性乙肝（CHB）以及從慢性乙肝（CHB）患者中篩檢肝癌(HCC)患者的生物學(xué)標(biāo)志物。由于本研究是針對(duì)GSPT2氨基端第1421-1531位堿基進(jìn)行的研究，其

4、間含有111個(gè)堿基，因此稱其基因?yàn)镚SPT2-111，其對(duì)應(yīng)的蛋白稱為eRF3b-37。本研究的目的是制備融合蛋白GST-eRF3b-37兔多克隆抗體和GST-eRF3b-37大鼠多克隆抗體，為今后研究乙肝標(biāo)志物提供了依據(jù)，同時(shí)為乙肝分子流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 (1)GSPT2-111的分子克隆。采用胍鹽酸法[14]從外周血中提取人基因組DNA，運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得大量GSPT2-1

5、11基因片段。將GSPT2-111基因片段通過(guò)BamHI和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)連接至pGEX-4T-1(GST)這一表達(dá)載體上，并應(yīng)用堿裂解法[14]提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切后進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定及測(cè)序分析。
　　 (2)融合蛋白GST-eRF3b-37的表達(dá)及可溶性鑒定。將GSPT2-111基因片段克隆到pGEX-4T-1(GST)這一表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α后，經(jīng)1.0mMIPTG誘導(dǎo)后獲得帶有GST

6、標(biāo)簽的GST-eRF3b-37融合蛋白，通過(guò)10％SDS-PAGE電泳，檢測(cè)融合蛋白表達(dá)及可溶性。
　　 (3)融合蛋白GST-eRF3b-37的純化。大量表達(dá)GST-eRF3b-37融合蛋白，通過(guò)GST SefinoseTM Resin純化帶有GST標(biāo)簽的GST-eRF3b-37融合蛋白，然后進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳，檢測(cè)GST-eRF3b-37融合蛋白純化情況。
　　 (4)多克隆抗體的制備。用融合蛋白GST-

7、eRF3b-37作為抗原對(duì)新西蘭大白兔和大鼠進(jìn)行免疫，取1ml PBS（其中含有1mg抗原）和等體積的完全弗氏佐劑乳化后在動(dòng)物背部6個(gè)不同的部位進(jìn)行皮下注射，每只家兔每個(gè)部位注射約300μl抗原溶液，每只大鼠每個(gè)部位注射約30μl抗原溶液。每?jī)芍苊庖咭淮?，連續(xù)4次。首次免疫用完全弗氏佐劑，后三次免疫用不完全弗氏佐劑。
　　 (5)多克隆抗體的檢測(cè)及純化。通過(guò)蛋白斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中是否存在融合蛋白GST-eRF3b-3

8、7抗體。采用Protein A親和層析柱對(duì)融合蛋白抗體進(jìn)行純化，純化后的抗體運(yùn)用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，并通過(guò)Western-blot方法檢測(cè)融合蛋白GST-eRF3b-37抗體的特異性。
　　 結(jié)果：
　　 (1)GSPT2-111的分子克隆。本研究從人外周血中成功克隆出GSPT2-111基因片段111bp。GSPT2-111編碼37個(gè)氨基酸，推測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為4.1kDa。
　　 (2)融合蛋白GST

9、-eRF3b-37的表達(dá)、可溶性鑒定及純化。含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GSPT2-111大腸桿菌DH5α經(jīng)1.0mM IPTG誘導(dǎo)，出現(xiàn)一分子量約30kDa的新蛋白表達(dá)，與GST（分子量為26kDa）和eRF3b-37(分子量約為4.1kDa)的理論分子量相符，并且為可溶性蛋白。通過(guò)GST SefinoseTM Resin純化出足夠免疫2只新西蘭大白兔和10只大鼠的融合蛋白，用融合蛋白對(duì)動(dòng)物進(jìn)行為期兩個(gè)月的免疫。
　　 (3

10、)多克隆抗體的檢測(cè)及純化。四次免疫后運(yùn)用蛋白斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)檢測(cè)出血清中存在融合蛋白GST-eRF3b-37抗體，再通過(guò)間接ELISA法測(cè)試抗體效價(jià)，純化前的兔抗體效價(jià)大于51，200，大鼠抗體效價(jià)大于12，800。收集動(dòng)物血清進(jìn)行Protein A親和層析柱純化，純化后的兔抗體效價(jià)大于384，000，IgG為60mg/ml。純化后的大鼠抗體效價(jià)大于25，600，IgG為25mg/ml。Western-blot結(jié)果顯示，無(wú)論是兔抗體按1：6

11、000稀釋，還是鼠抗體按1:3000稀釋，純化出的抗體均可檢測(cè)出清晰的分子量約為30kDa的GST-eRF3b-37融合蛋白的條帶。
　　 結(jié)論：
　　 (1)克隆出了GSPT2-111基因片段，并且構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GSPT2-111。
　　 (2)表達(dá)并且純化出GST-eRF3b-37融合蛋白。
　　 (3)制備并且純化出兔抗人GST-eRF3b-37多克隆抗體和大鼠抗人GST-eRF