櫻桃谷鴨CD3ε胞外區(qū)多肽的原核表達(dá)、抗體制備及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究通過原核表達(dá)櫻桃谷鴨CD3ε胞外區(qū)，制備兔抗鴨的CD3ε多克隆抗體，利用制備的抗體建立一種用于測定或分選出鴨的CD3+T細(xì)胞亞群的方法，由于鴨瘟病毒主要侵害的是上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，運(yùn)用此方法為闡明鴨瘟的致病機(jī)理提供依據(jù)，為以后進(jìn)一步研究水禽疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律提供手段。
　　 根據(jù)GenBank中收錄北京鴨CD3ε基因序列（AF378704）設(shè)計合成了特異性的引物，擴(kuò)增了櫻桃谷鴨和麻鴨CD3εORF基因，測定基因序列，將其登錄

2、到Genbank，其登錄號分別為FJ524847和FJ524848。應(yīng)用BLAST和DNASTAR等生物學(xué)軟件比對分析表明：櫻桃谷鴨、麻鴨、北京鴨間CD3ε基因ORF序列相互之間同源性都為99％。通過Clustalx（1.83）分析鴨的CD3ε基因ORF推導(dǎo)氨基酸序列差異，最保守的部位是ε鏈多肽的胞質(zhì)區(qū)，而最不保守的是胞外區(qū)。根據(jù)櫻桃谷鴨CD3ε序列，設(shè)計特異性的一對引物克隆胞外區(qū)。分別構(gòu)建了DuCD3ε胞外區(qū)基因的原核表達(dá)質(zhì)粒（pET

3、-28a-DuCD3ε），并在E．coli BL21（DE3）中成功獲得了表達(dá)，將純化的重組蛋白作為免疫原，通過設(shè)計好的免疫程序，成功制備了兔抗重組蛋白的高免血清，通過間接ELISA測定兔抗rDuCD3ε抗體效價為1：51200。所得高免血清分別采用飽和硫酸銨粗提和Sephadex G-200過柱純化，得到純化的抗體。
　　 用鴨瘟病毒感染35日齡櫻桃谷鴨，在感染后4d開始，感染鴨出現(xiàn)鴨瘟的特征性形態(tài)學(xué)變化，如病鴨頭頸部腫大；剖

4、檢變化有腸道開始明顯環(huán)狀出血病理變化，同時在感染病毒后期的脾臟組織中，應(yīng)用透射電鏡觀察到病毒粒子，證實鴨瘟的病理模型構(gòu)建成功。在感染后1d、2d、3d、4d、5d、6d分別采取外周血液，制作血涂片檢測。
　　 應(yīng)用制備的兔抗櫻桃谷鴨CD3ε多克隆抗體建立了檢測鴨外周血中CD3陽性T淋巴細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色方法，具有較好的特異性。運(yùn)用此方法對鴨瘟病毒感染后1d、2d、3d、4d、5d、6d鴨外周血液中CD3+T淋巴細(xì)胞的檢測表明