睪丸抗原OY-TES-1羧基端截短蛋白的制備及鑒定.pdf

1、目的：構建OY-TES-1羧基端截短蛋白(OY-TES-1-C)重組質(zhì)粒、體外表達OY-TES-1-C蛋白，對表達產(chǎn)物進行純化和鑒定，為OY-TES-1后續(xù)研究奠定基礎。 方法：(1)提取人睪丸組織總RNA，逆轉(zhuǎn)合成cDNA;(2)擴增OY-TES-1羧基末端253(S291-G543)個氨基酸的cDNA序列；(3)將PCR擴增產(chǎn)物插入原核表達載體pMAL-C2，構建pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化DH5α菌

2、進行pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒擴增；(4)通過藍白斑篩選、DNA測序篩出正確的pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta菌；(5)用IPTG對重組菌進行誘導表達，優(yōu)化IPTG使用的濃度和加入時機，以及誘導溫度和誘導時間；(6)在優(yōu)化條件下表達融合蛋白MBP-OY-TES-1-C，通過Amylose-resin親和層析柱純化；(6)將純化后的MBP-OY-TES-1-C蛋白進行Wester

3、n Blot鑒定。 結果：重組質(zhì)粒pMAL-C2-OY-TES-1-C測序與已知序列相同；成功誘導表達出融合蛋白MBP-OY-TES-1-C。確定了pMAL-C2- OY-TES-1-C體外表達的優(yōu)化條件：37℃振蕩培養(yǎng)3小時，加入IPTG(終濃度為0.7mmol/L)，然后在32℃振蕩培養(yǎng)4小時；表達出與預計分子量符合的融合蛋白。 結論：成功構建了pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒，通過E.coli表達出MB