間歇性低氧細胞模型的建立及驗證.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(Obstructive sleep apnea hypopneasyndrome，OSAHS)是一種高發(fā)性疾病，可產(chǎn)生心血管疾病及認知功能障礙等多種并發(fā)癥。OSAHS主要發(fā)病機制為間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH），目前大多學(xué)者通過構(gòu)建間歇性低氧動物模型從動物水平研究OSAHS病理生理機制。而在細胞模型方面，由于氧氣彌散困難及細胞耗氧等問題，OSAHS細胞模型研

2、究進展緩慢。HIF-1α是人體重要缺氧適應(yīng)性因子，對缺氧異常敏感，OSAHS動物模型中表達明顯增加。本研究自主研發(fā)設(shè)計氣體環(huán)境細胞模型，模擬OSAHS間歇性低氧細胞暴露特點，并通過監(jiān)測培養(yǎng)基中溶解氧變化及人肺腺癌A549細胞HIF-1α表達變化驗證該模型，為深入開展OSAHS機制研究及治療提供實驗平臺。
　　方法：
　　1.氧艙制備:定制帶溫控系統(tǒng)的細胞培養(yǎng)實驗艙和空氣模擬對照艙，采用電腦和PLC主機系統(tǒng)控制氧氣、氮氣、二氧

3、化碳及空氣的進出，空氣模擬對照艙內(nèi)空氣輸注與實驗艙內(nèi)氧氣和氮氣輸注同步。調(diào)整各氣體流量控制閥和減壓閥，使實驗艙和對照艙內(nèi)各氣體濃度快速達到并穩(wěn)定至要求濃度。
　　2.間歇性低氧細胞模性建立及驗證:維持實驗艙和對照艙為37℃、5％CO2，取無菌六孔板，每孔添加3mm空白培養(yǎng)基，將艙內(nèi)氧濃度從20％迅速降至5％，檢測培養(yǎng)基中溶解氧分壓，繪制氧分壓-時間曲線。根據(jù)氧分壓-時間曲線特點，當培養(yǎng)基中氧分壓至56±4mmHg時，維持10～40

4、s，統(tǒng)計所需缺氧時間。再將艙內(nèi)氧濃度從5％升至20％，記錄達到正常氧分壓時間，最后得出間歇性低氧循環(huán)低氧-復(fù)氧時間。
　　根據(jù)所得間歇性低氧循環(huán)低氧和復(fù)氧時間，設(shè)計IH模式。，將傳代培養(yǎng)的A549細胞隨機分為7組:正常對照組（C組）;間歇低氧6小時組(6IH)，即5％O260min/20％O230min，6小時;間歇低氧9小時組(9IH);空氣模擬對照組6小時組(6AC);空氣模擬對照組9小時組(9AC);持續(xù)低氧4小時組(4SH

5、)，即持續(xù)5％O24小時;持續(xù)低氧6小時組(6SH)。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，實時熒光定量PCR法檢測各組細胞HIF-1α mRNA及免疫組化法測HIF-1α的蛋白表達變化。
　　結(jié)果：
　　1.模型驗證維持實驗艙和空氣模擬對照艙在37℃恒溫、5％CO2，實驗艙和空氣模擬對照艙實際CO2濃度為4.89％±1.02、5.29％±0.48;實驗艙氧濃度為5％或20％時，艙內(nèi)實際氧濃度為4.47％±0.52、20.03％±1

6、.08。5％O2暴露條件時，培養(yǎng)基中氧分壓達到56±4mmHg所需時間為59.48±0.32min;將培養(yǎng)基氧分壓降至56±4mmHg時迅速將艙內(nèi)氧濃度從5％升至20％，氧分壓升至155±4mmHg時所需時間為28.00±0.48min。根據(jù)OSAHS低氧間歇為10～40s特點，設(shè)置該模型間歇性低氧條件為5％O260min/20％ O230min。
　　2.倒置顯微鏡下各組細胞形態(tài)改變與正常組相比，空氣模擬對照6AC、9AC組細胞

7、表現(xiàn)為正常細胞形態(tài)，細胞呈多角形或不規(guī)則形，大小均一，細胞連接成簇。6IH、9IH和6SH組部分細胞出現(xiàn)突起、變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多黑色顆粒聚集，細胞邊界模糊，9IH組變化較明顯，4SH組細胞形態(tài)未見明顯異常。
　　3.免疫組化法檢測HIF-1α蛋白表達 HIF-1α主要在A549細胞核中表達，與6AC、9AC組比較，6IH、6SH、9IH組HIF-1α蛋白表達增加（P＜0.05），9IH組更明顯(P＜0.05)，6IH與6SH組無

8、差明顯差異(P＞0.05);4SH、6AC、9AC組與正常對照組表達無差異（P＞0.05）。
　　4.HIF-1αmRNA表達變化IH組A549細胞HIF-1α mRNA表達升高（P＜0.05）;與6IH組比較，9IH組HIF-1αmRNA表達量明顯增加（P＜0.05）;6IH組、9IH組HIF-1αmRNA分別高于4SH和6SH組（P＜0.05）;6AC、9AC組與正常對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：