人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞特性研究和人海綿狀血管瘤動(dòng)物模型的建立.pdf

1、血管瘤是最常見的嬰幼兒良性血管增生或血管畸形，好發(fā)于顏面部，常因引起嚴(yán)重的面部畸形而影響患者身心健康。盡管血管瘤的形成可能與活躍的血管生成有關(guān)，但是其發(fā)病機(jī)制還不明了。而且目前對血管瘤的治療尚缺乏安全有效的藥物，因此，研究血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的表型和功能特性，并建立一個(gè)血管瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對血管瘤發(fā)病機(jī)制的研究和臨床治療藥物的篩選有非常重要的意義。 目的研究人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)、表型、功能和基因方面的改變，探索海綿狀血管瘤的發(fā)生

2、機(jī)制；建立人海綿狀血管瘤的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并篩選對海綿狀血管瘤有效的治療藥物。 方法從人海綿狀血管瘤組織分離、純化血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)鑒定其內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志性分子的表達(dá)。應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的表型特征；應(yīng)用Matrigel比較血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)能力的差別；應(yīng)用RT-PCR研究海綿狀血管

3、瘤內(nèi)皮細(xì)胞上VEGF及其受體、Ang-1、Ang-2和Tie2的表達(dá)。海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶分別通過明膠酶譜法、RT-PCR、Westernblot和細(xì)胞免疫熒光染色進(jìn)行分析。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定檢查海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞釋放的U-PA、PAI-1和TF。通過將熒光染料標(biāo)記的血小板與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)比較血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞與血小板粘附能力的差別。此外，應(yīng)用RT-PCR方法，比較252-基因在血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，正

4、常血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)差別，并應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察252-基因轉(zhuǎn)染后對人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常的影響。 將人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同接種于裸鼠皮下，誘導(dǎo)血管瘤模型的形成。通過移植表達(dá)綠色熒光蛋白的海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，并觀察血管瘤模型組織切片中綠色熒光的分布，判斷血管瘤模型中血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源。另外，通過體外MTT分析，篩選對海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖有抑制作用的藥物，并在血管瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評

5、價(jià)所篩選藥物對海綿狀血管瘤的療效。 結(jié)果分離的人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)單層生長和接觸抑制的特性。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有大量的線粒體、異常膨大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡樣結(jié)構(gòu)。表型分析顯示，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志性分子vWF，CD31和HSP，但不表達(dá)CD34。與正常人血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)類似水平的兩種TNF受體和ICAM-1，但表達(dá)整合素αvβ3分子的水平明顯升高。RT

6、-PCR，酶譜分析和ELISA結(jié)果顯示：人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有高表達(dá)的內(nèi)源性VEGF和Ang1，Ang2，但VEGF受體和Tie2的表達(dá)水平正常，同時(shí)與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的酶原形式和激活形式的基質(zhì)金屬蛋白酶，并表現(xiàn)凝血活性和纖溶活性的升高。功能研究發(fā)現(xiàn)，人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在體外形成與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不同的異常血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成方面與正常內(nèi)皮細(xì)胞不同?；虮磉_(dá)研究發(fā)

7、現(xiàn)，252-基因在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞有表達(dá)，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，但是在人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞缺乏252-基因的表達(dá)。將構(gòu)建的252基因轉(zhuǎn)入海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，有異常膨大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞比例明顯降低。 將海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞與少量腫瘤細(xì)胞移植到裸鼠皮下后，可以在細(xì)胞移植部位形成類似于血管瘤的結(jié)構(gòu)，組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)形成了較大的血竇，這與人海綿狀血管瘤的病理表現(xiàn)類似。移植表達(dá)綠色熒光蛋白的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)綠色熒光在

8、血管瘤樣組織中沿血管結(jié)構(gòu)分布，說明血管瘤模型中血管內(nèi)皮細(xì)胞來源于移植的表達(dá)綠色熒光蛋白的人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。MTT分析發(fā)現(xiàn)一種中藥提取物，876-3對人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，在血管瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)876-3對實(shí)驗(yàn)性血管瘤具有明顯治療效果。 結(jié)論人海綿狀血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)、表型、功能特性和基因表達(dá)上都不同于正常組織起源的血管內(nèi)皮細(xì)胞。252-基因表達(dá)的缺失可能是導(dǎo)致海綿狀血管瘤發(fā)病的機(jī)制，但需