人骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導為心肌細胞的實驗研究.pdf

1、研究目的： 1.通過對人骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取、分離、培養(yǎng)和鑒定的方法和條件的研究，觀察人骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學和掌握其生長規(guī)律，找到一種最佳的培養(yǎng)環(huán)境，建立一套體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，為深入研究人骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞特性和在組織工程方面的應用奠定基礎(chǔ)； 2.通過不同濃度的5-氮胞苷(5-aza)誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為心肌細胞的比較，確定一種合適的誘導濃度；通過對5-aza誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)

2、化為心肌樣細胞后進行鑒定，以確定心肌樣細胞的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能； 3.通過觀察內(nèi)皮素-1在誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞中的作用，以確定其是否可以促進人骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化。 方法和結(jié)果：本研究共分三部分第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細胞在體外分離、培養(yǎng)及鑒定方法：標本來源于人的骨髓。采用淋巴細胞分離液行密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，再利用貼壁篩選法純化骨髓間充質(zhì)干細胞后，進行原代和傳代培養(yǎng)，并對其進行細

3、胞生長和形態(tài)學的觀察、表面抗原的鑒定。 結(jié)果：hMSCs原代培養(yǎng)接種24h貼壁完成，2-3天細胞呈梭形，第9天形成多個克隆，第14-16天細胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，細胞排列成漩渦狀。傳代細胞24h內(nèi)完全貼壁，伸展成梭形，開始迅速增殖，7天即鋪滿培養(yǎng)瓶底，傳代細胞保持原代細胞的形態(tài)特征。隨代數(shù)增加，細胞得到純化，梭形細胞達95％以上。連續(xù)傳代至P8，細胞由梭形變?yōu)槠教埂挻?，分裂相減少，細胞質(zhì)疏松，可見空泡。

4、傳至P10,部分細胞變成圓形，折光增強，脫壁死亡。隨著傳代次數(shù)的增加，克隆形成率逐漸下降，10代后無明顯克隆出現(xiàn)。hMSCs表達CD29，CD44，但不表達CD34，CD45。 第二部分5-氮胞苷誘導人骨髓間質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞方法：第二代的hMSCs中分別加入濃度為2.5、5、10、20、40、80μmol/L的5-aza，作用24h后除去，繼續(xù)培養(yǎng)4周，觀察細胞的生長和形態(tài)學的變化，于誘導后第二周進行免疫組化染色檢測cT

5、nI，并計算陽性細胞轉(zhuǎn)化率。利用RT-PCR技術(shù)，于誘導后1、2、3、4w，對hMSCs的ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4、Nkx2.5的基因表達進行檢測。應用膜片鉗技術(shù)對誘導后2w的hMSCs進行動作電位檢測。 結(jié)果：5-氮胞苷處理24h后，各組均有部分細胞發(fā)生死亡，2.5、5和10μmol/L組僅有少量細胞死亡，而20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L組約30％細胞死亡

6、。誘導后7d，細胞形態(tài)出現(xiàn)變化。細胞多緊密平行排列生長，細胞體積變大，梭形細胞比例下降，多數(shù)細胞呈桿狀，少部分細胞呈不規(guī)則外形、長梭形或橢圓形。40μmol/L、80μmol/L組細胞形態(tài)變化明顯。2-3w，細胞增殖減慢，部分細胞脫壁死亡，細胞數(shù)量較同期未經(jīng)誘導組明顯減少，其中40、80μmol/L5-aza組尤為明顯，死亡細胞數(shù)約占50％以上。相鄰細胞間胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀，細胞核/漿比例明顯降低，胞漿內(nèi)有細小的顆粒樣結(jié)構(gòu)，且

7、顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細胞核周圍，大約30％左右細胞胞漿內(nèi)可見細絲樣結(jié)構(gòu)。4w時，40、80μmol/L組細胞的折光性減低、細胞活性減弱，繼續(xù)出現(xiàn)死亡的細胞。未觀察到轉(zhuǎn)化細胞的自主搏動。誘導后4w，超微結(jié)構(gòu)觀察顯示典型肌小節(jié)結(jié)構(gòu)和心房顆粒。誘導后2w，5、10、20、40、80μmol/L組hMSCs可見cTnI表達陽性。cTnI陽性染色細胞數(shù)率比較，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L組之間無明顯差異，均

8、明顯高于5μmol/L組(P＜0.05)。RT-PCR檢測到ANP，BNP，α-skeletalactin，MLC-2v，Nkx2.5/Csx，GATA-4基因表達，且逐漸增加；10μmol/L組的各基因表達在不同時間點上與其它各組相比較在數(shù)值上均高于其它各組，在大部分點上差異顯著(P＜0.05)，部分無顯著差異(P＞0.05)。誘導后2w的hMSCs檢查到動作電位。 第三部分內(nèi)皮素-1在誘導人骨髓間質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞中的

9、作用方法：第二代hMSCs分別加入5-aza(10μmol/L)，ET-1(30nmol/L)，5-aza(10μmol/L)+ET-1(30nmol/L)，分為對照組(Ⅰ組)、ET-1組(Ⅱ組)、5-aza組(Ⅲ組)和5-aza+ET-1聯(lián)合誘導組(Ⅳ組)，作用24h后除去，繼續(xù)培養(yǎng)4周，觀察細胞的生長和形態(tài)學的變化，于誘導后第二周進行免疫組化染色檢測cTnI，并計算陽性細胞轉(zhuǎn)化率。利用RT-PCR技術(shù)，于誘導后1、2、3、4w,對h

10、MSCs的ANP、BNP、α-skeletalactin、MLC-2v、GATA-4、Nkx2.5的基因表達進行檢測。 結(jié)果：Ⅲ組和Ⅳ組的hMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞，Ⅳ組轉(zhuǎn)化的心肌樣細胞體積大，形態(tài)較成熟，Ⅰ組、Ⅱ組的hMSCs未向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化。于誘導后第二周進行免疫組化染色檢測cTnI，Ⅲ組和Ⅳ組表達陽性，Ⅳ組的染色較深，Ⅰ組、Ⅱ組為陰性。Ⅲ組和Ⅳ組RT-PCR檢測到ANP，BNP，α-skeletalactin，MLC-2

11、v，Nkx2.5/Csx，GATA4基因表達，基因表達量均隨著時間逐漸增加，Ⅰ組、Ⅱ組為陰性。Ⅳ組和Ⅲ組相比較，ANP表達在3、4w，差異顯著；BNP表達只在1w時，差異顯著；α-skeletalactin表達，3、4w差異顯著；MLC-2v，1、2、3、4w均差異顯著；GATA-4和Nkx2.5表達，無明顯差異。 結(jié)論： 1.利用淋巴細胞液進行密度梯度離心法和貼壁篩選法，可分離、純化人骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞的均一性高，

12、是一種簡單、經(jīng)濟、有效的分離提純?nèi)斯撬栝g充質(zhì)干細胞的方法。 2.人骨髓間充質(zhì)干細胞可在體外分離、提純、擴增，細胞數(shù)量足夠、遺傳背景穩(wěn)定可滿足組織工程的要求，是理想的種子細胞之一。 3.5-aza誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化，10μmol/L是較佳的誘導濃度。 4.經(jīng)5-aza誘導的人骨髓間充質(zhì)干細胞有肌管形成，具有心肌細胞的特異的免疫組化表現(xiàn)，表達心肌細胞的特定基因，為胎兒型心室細胞。5.內(nèi)皮素-1可促