血清腫瘤標志物譜及趨化因子蛋白譜提高肺癌早期診斷及預后預測的臨床研究.pdf

1、肺癌已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤，同時研究證明吸煙是促進肺癌發(fā)生的主要危險因素。研究肺癌發(fā)病的分子病理機制并發(fā)現(xiàn)肺癌特異的生物標志物成為目前肺癌臨床研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究的重點，進一步為肺癌個體化治療提供更多的依據(jù)。生物標志物被定義為“一種具有可以被客觀測量和評價正常生理過程、病理過程，或?qū)χ委煾深A的藥理/藥效學反應的指標”，具體的檢測方法包括免疫組化(組織中原位的表達)；基因變異(包括基因的擴增、突變和重排)；單核苷酸多態(tài)性檢測

2、(single nucleotide polymorphisms，SNP)以及廣譜的或靶向的基因和蛋白的表達分析。
　　 在肺癌早期診斷方面，低劑量螺旋計算機斷層掃描(low dose spiralcomputerized tomography，LDCT)篩查雖然可以提示放射科醫(yī)生和肺科醫(yī)生發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肺內(nèi)的小結(jié)節(jié)，但是無法判斷是否是早期肺癌，同時往往存在假陽性。即使結(jié)合了正電子發(fā)射型計算機斷層掃描顯像(positron emis

3、sion computedtomography，PET)和非開胸手術活檢等檢查，其真陽性，即敏感性仍較低，并且增加了一定手術風險。但是通過聯(lián)合分子生物學的檢測技術，來輔助影像學的檢查，可以顯著提高肺癌早期診斷的特異性。這些生物標志物包括檢測外周血清中特定的腫瘤標志物，或呼出氣體揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)及呼出氣冷凝液(exhaled-breath condensate，EBC)的檢

4、測。在一項我們的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合目前己知的腫瘤標志物[癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)、鱗狀細胞癌抗原(squamous cell carcinoma，SCC)、細胞角蛋白19的片段(cytokeratin19 Fragment，Cfyra21-1)]，與一種新型的腫瘤標志物，胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide，ProGRP)，可以提高肺癌診斷的敏感性和特

5、異性，這種新的方法，可以幫助臨床醫(yī)生，診斷一些在CT影像中存在疑問的肺癌患者。類似的，通過針對呼出氣體分子學檢測的運用，也可以提高影像學檢查的有效性。
　　 在肺癌治療效果方面，生物標志物變得尤為重要。在肺癌患者中，目前對單次化療或抗腫瘤藥物治療的反應率普遍低于其它疾病的治療效果。另外，化療藥物的有效濃度往往接近甚至與毒性濃度重合。因此，針對肺癌患者進行分層，同時篩選出對特定治療方案最為敏感的人群，對患者和醫(yī)生而言都具有非常重要

6、的臨床價值。目前分子靶向藥物的臨床運用，便是運用了生物標志物篩查的方法，來預測患者對特定藥物的治療效果[包括反應率、無進展存活時間(progressionfree survival，PFS)和總生存時間(overall survival，OS)]。例如通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變的檢測，可以從肺癌患者中篩選出一小部分具有該基因位點突變的人群，與其他肺癌患者相比

7、，這類患者對于酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的治療具有更高的敏感性。目前，該項檢查已被列入肺癌臨床治療的推薦指南中。與此同時，其它的一些生物標志物，例如K-RAS基因突變、EML4/ALK基因突變及針對抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)治療的生物標志物等，仍在繼續(xù)研究中，以獲取更多的具有信服力的臨床證據(jù)。在不久的將來，通過生

8、物標志物的研究還將為我們提供開發(fā)新藥的信息和依據(jù)，從而降低研發(fā)的經(jīng)濟和時間成本。
　　 從系統(tǒng)生物學的角度來看，目前許多基于以往關于蛋白功能網(wǎng)絡研究結(jié)果的數(shù)據(jù)庫，已被免費公開，可以供我們使用。通過計算機數(shù)學模型的運用，在這些數(shù)據(jù)庫中篩選出具有較高癌變相關值的網(wǎng)絡蛋白譜。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)了三種類型的生物標志物，包括與腫瘤細胞生長相關的生物標志物，例如絲裂原活化蛋白激酶家族中(mitogen-activated protein k

9、inases，MAPK)，MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)及MAPK14(p38α)；SMAD蛋白家族(SMAD1、SMAD2、SMAD3和SMAD4)；受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)中的EGFR、成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor1，F(xiàn)GFR1)和胰島素受體(insulin receptor，INSR)；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的C

10、REBBP、CTNNB1(β-連環(huán)素)、E2F1和MYC。與腫瘤細胞存活相關的生物標志物，包括TP53(p53)、TRAF6、BRCA1、SP1、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine-specific protein kinase，AKT)及CSNK2A1(CK2)。以及與腫瘤細胞遷徙相關的生物標志物，包括PTK2(FAK)、TSC2、PLCG1和Ezrin。
　　 本課題通過在兩個肺癌患者隊列的研究，分別利用血

11、清腫瘤標志物譜或血清趨化因子蛋白譜測定的方法，來尋找在肺癌早期診斷及預后預測中具有重要作用的生物標志物。另外，本課題在分析了我國導致肺癌診斷周期(diagnostic lead time，DLT，定義為從癥狀出現(xiàn)到臨床診斷的時間)延長的潛在因素，并首次建立了一套肺癌患者數(shù)字化臨床評估系統(tǒng)(digital evaluation score system，DESS)，用來將臨床上描述性的信息轉(zhuǎn)換為臨床生物學信息。通過蛋白質(zhì)組學和臨床數(shù)據(jù)的相

12、互整合，我們發(fā)現(xiàn)了一組肺癌生物標志物，具有較高的敏感性和特異性，并且可以顯著減少肺癌的診斷周期。
　　 第一部分血清腫瘤標志物譜在具有肺癌相關癥狀和高危因素的肺癌患者隊列中早期診斷的作用
　　 目的：本研究使用一組肺癌特異性指標譜為臨床醫(yī)生提供診斷信息，以便鑒別診斷小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)患者。

13、r>　　 方法：測定89名具有肺癌高危因素的健康對象、12名小細胞肺癌和52名非小細胞肺癌患者血清中ProGRP、CEA、SCC和Cyfra21-1四種腫瘤標志物指標。診斷周期的資料，通過針對所有研究對象進行面談獲得。
　　 結(jié)果：小細胞肺癌患者的ProGRP顯著升高(p<0.0001)，腺癌患者CEA顯著升高(p<0.0001)，而鱗癌患者SCC和Cyfxa21-1均顯著升高(p<0.0001)。分別對各指標進行界限值的設定

14、，其中ProGRP為300 pg/mL，CEA為7.3 ng/mL，SCC為3ng/mL以及Cyfra21-1為6.5ng/mL。以ProGRP診斷小細胞肺癌的敏感性和特異性分別為75％和100％。通過加入ProGRP的運用，可以增加目前診斷NSCLC的腫瘤標志物譜的特異性(從88.1％上升至94.1％)，并保持敏感性維持不變(75％)。在64名肺癌患者中，因患者因素導致的診斷周期的中位數(shù)為17天(四分位區(qū)間為2-33天)，在醫(yī)療系統(tǒng)中

15、的診斷周期為18天(四分位區(qū)間為14-33天)。僅有78.1％的肺癌患者可以通過CT檢查得到陽性結(jié)果，而通過聯(lián)合運用這四種生物標志物，發(fā)現(xiàn)了8例臨床CT假陰性的NSCLC患者，這些病例可能在臨床上會造成診斷周期的延長。
　　 結(jié)論：研究所采用的這組血清腫瘤標志物譜提高了在高危健康人群中(除腎衰患者外)篩查肺癌的特異性，同時也提高了在具有惡性腫瘤患者中診斷肺癌的敏感性。通過在臨床中使用該組生物標志物譜，將可能縮短我國基層醫(yī)療機構(gòu)和

16、?？漆t(yī)院針對肺癌的診斷周期。
　　 第二部分血清趨化因子蛋白譜在非小細胞肺癌患者中對肺癌發(fā)生與預后的影響
　　 目的：炎癥在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。本研究通過多重血清細胞因子的定量測定和分析，旨在發(fā)現(xiàn)可以預測接受化療的非小細胞肺癌(NSCLC)患者預后的生物標志物。
　　 方法：收集健康非吸煙志愿者的血清標本(14例)，及NSCLC患者(50例，女性14例，男性36例，平均年齡58.0±11.4歲；36

17、例腺癌，臨床分期Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ期；和14例鱗癌，臨床分期Ⅰ至Ⅳ期)在入院當天診斷前采集血清標本。5例Ⅳ期腺癌患者在第2次和第3次入院時重復采樣，以獲得第1次和第2次化療后的血清樣本(即在首次診斷治療后的第21天和第42天)。應用多重細胞因子免疫檢測方法同時檢測40種細胞因子的表達情況，通過肺癌臨床生物信息量表采集臨床信息并轉(zhuǎn)換為數(shù)字的患者臨床信息，所有的患者均完成長達2年的生存周期的隨訪。應用成組t檢驗及Mann-Whitney U檢驗比較

18、40種細胞因子在不同類型肺癌患者血清中表達情況的差異，使用Mann-Whitney U檢驗比較各組肺癌患者間數(shù)字化信息量表數(shù)值，并用Stepwise多因素回歸分析及Kaplan-Meier生存分析判定影響非小細胞肺癌生存預后的獨立相關危險因素。
　　 結(jié)果：在檢測的40種炎癥細胞因子，13種細胞因子在所有的肺癌患者中與健康對照組之間存在顯著差異，18種細胞因子在腺癌患者中與健康對照組之間存在顯著差異，11種細胞因子在鱗癌患者中與

19、健康對照組之間存在顯著差異。在Ⅳ期腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，有9種細胞因子在接受化療前和第一次化療后之間存在顯著差異，有13種細胞因子在接受化療前和第二次化療后之間存在顯著差異。數(shù)字化臨床評估系統(tǒng)(DESS)檢測發(fā)現(xiàn)，在“原發(fā)腫瘤引起的癥狀”分值中，腺癌與鱗癌患者中具有顯著差異(p=0.005)。在29例腺癌患者(臨床分期ⅢB和Ⅳ期)中，血清中高表達單核細胞趨化因子4(monocyte chemoattractant protein4，MCP-4

20、)、人生長調(diào)節(jié)致癌基因(growth-regulated oncogcne，GRO)、胸腺表達趨化因子(thymus expressed chemokine，TECK)和巨噬細胞刺激蛋白α(macrophage stimulating proteinα，MSPa)組的患者較正常表達組的患者具有較高的死亡風險，相反地，高表達可與糖蛋白D競爭皰疹病毒進入T細胞位點的TNF樣誘導蛋白(lymphotoxin-like inducible pr

21、otein that competes withglycoprotein D for herpesvirus entry on T cells，LIGHT)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(cutaneous T-cell attracting chemokines/CCL27，CTACK)、趨化因子配體28(C-C motif ligand28，CCL28)和白介素-29(interleukin-29，IL-29)組的患者較正常表達組的患者具