C2C12細胞成肌分化基因芯片統(tǒng)合分析及Lrrc75b對成肌分化的作用.pdf

1、[目的]：
　　1.對C2C12細胞成肌分化芯片進行統(tǒng)合分析，篩選出C2C12細胞成肌分化一致性差異表達基因集，并采用生物信息學軟件分析成肌分化相關基因本體和信號轉導通路。
　　2.探討差異表達基因Lrrc75b對C2C12細胞成肌分化的影響及作用機制。
　　[方法]：
　　1.采用dChip軟件對GEO數(shù)據庫中C2C12成肌分化芯片GSE4694、GSE5447、GSE5305進行分析。采用GATHER軟件對一

2、致性上調（或下調）基因集進行基因本體、KEGG Pathway富集分析。
　　2.用2％馬血清對C2C12細胞進行成肌分化誘導，顯微鏡下觀察成肌分化0d，1d，3d，5d的細胞形態(tài)變化及肌管形成;收集成肌分化0d，1d，3d，5d蛋白質，Western印跡實驗檢測成肌標志蛋白myogenin，MyHC的表達情況。
　　3.用2％馬血清對C2C12細胞進行成肌分化誘導，提取成肌分化0d，1d，3d，5d細胞RNA，qRT-PC

3、R檢測Lrrc75b在成肌分化過程的時序表達模式。
　　4.Lrrc75b stealth RNAi轉染C2C12細胞，進行成肌分化誘導，于第3d進行免疫熒光染色，觀察肌管形成情況;Western印跡實驗檢測成肌分化0h，12h，24 h，48 h，72 h myogenin，MyHC蛋白表達情況及成肌分化0h，24 h，48h，72 h ERK1/2蛋白的表達變化。
　　5.Lrrc75b重組腺病毒感染C2C12細胞，進行

4、成肌分化誘導，于第5d進行免疫熒光染色，觀察肌管形成情況;Western印跡實驗檢測成肌分化0d，1d，3d，5 d myogenin，MyHC蛋白表達情況及ERK1/2蛋白的表達變化。
　　[結果]：
　　1.通過對C2C12成肌分化基因芯片進行分析，篩選出GSE4694中上調表達基因1497個，下調表達基因1539個;GSE5447中上調表達基因2378個，下調表達基因2439個;GSE5305中上調表達基因1177個，

5、下調表達基因2101個。對上述結果進行統(tǒng)合分析，在2個及以上實驗數(shù)據中均出現(xiàn)差異表達的一致性上調表達基因集932個，一致性下調表達基因集1198個。GATHER軟件分析表明:一致性上調表達基因集中富集GO:0006936(muscle contraction)，GO:0007517(muscle development)等基因本體;mmu04910(Insulin signalling pathway)，mmu04020(Calcium

6、 signalling pathway), mmu04010(MAPK signaling pathway)等信號通路。而一致性下調表達基因集中主要富集GO:0007049(cell cycle)，GO:0008283(cell proliferation)等基因本體;mmu00240(Pyrimidine metabolism)，mmu00230(Purine metabolism)等代謝相關信號通路。
　　2.C2C12細胞形

7、態(tài)呈梭形，均一;當細胞處于成肌分化誘導液培養(yǎng)，2d后細胞開始融合，出現(xiàn)兩個核以上的肌管，隨著成肌誘導時間的延長，肌管數(shù)量逐漸增加，肌細胞逐漸融合，肌管逐漸變大變長。Western印跡實驗結果顯示成肌分化過程成肌分化標志蛋白myogenin，MyHC表達逐漸增加。
　　3.基因芯片分析結果提示Lrrc75b在成肌分化中表達下調。在C2C12成肌分化模型，qRT-PCR結果進一步證明，成肌分化過程Lrrc75b mRNA表達水平逐漸降

8、低。
　　4.免疫熒光染色結果顯示，與si-Control組比較，si-Lrrc75b組肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯增加，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與Ad-GFP組比較，過表達Ad-Lrrc75b組肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯減少，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.與si-Control組比較，sj-Lrrc75b組成肌標志蛋白myogenin，MyHC的表達量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.

9、05);與Ad-GFP組比較，過表達Ad-Lrrc75b組myogenin蛋白表達量明顯減少，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.與si-Control組比較，si-Lrrc75b組抑制ERK1/2磷酸化水平;與Ad-GFP組比較，過表達Ad-Lrrc75b組上調ERK1/2磷酸化水平。
　　[結論]：
　　1.成肌分化芯片Meta分析結果顯示，一致性上調表達基因集932個，一致性下調表達基因集1198個

10、，其中Lrrc75b是一致性下調表達基因。
　　2.在C2C12細胞成肌分化模型，伴隨成肌分化的發(fā)生，Lrrc75b mRNA表達水平逐漸降低，與基因芯片Meta分析結果相符合。
　　3.在C2C12成肌分化過程，通過RNAi方法特異性降低Lrrc75b基因表達，肌管面積、肌管融合指數(shù)明顯增加;myogenin，MyHC蛋白表達量明顯增加。結果表明下調Lrrc75b表達，促進C2C12細胞成肌分化。
　　4.通過重組腺